趙長(zhǎng)江，代晨晨，范博文，張圣也，張海燕

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/黑龍江省秸稈資源化利用工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319)

食用菌因其味美、營(yíng)養(yǎng)、保健和藥用等多重用途[1-2]，尤其是可以不與糧食爭(zhēng)地的方式生產(chǎn)人類優(yōu)質(zhì)食品，而備受青睞。中國(guó)已成為食用菌生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，安全的、規(guī)?；氖秤镁a(chǎn)業(yè)對(duì)于保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[3-5]。

但是，伴隨食用菌的規(guī)?；耘啵z體培養(yǎng)和子實(shí)體培養(yǎng)階段時(shí)刻面臨“雜菌”的危害，成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因素之一?！半s菌”與食用菌之間既可能是寄生關(guān)系，也可能是相互拮抗作用，還可能是一種相互競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[6]。其中，鏈孢霉(Neurosporasitophila)和紅 色 面 包 霉(Neurosporaspp.)為典型的競(jìng)爭(zhēng)性霉菌，在食用菌生產(chǎn)中普遍發(fā)生，具有范圍廣、來勢(shì)猛、繁殖快、防治難、損失大的特點(diǎn)[7-8]。目前，物理預(yù)防和化學(xué)防治措施相結(jié)合仍是食用菌生產(chǎn)中脈孢酶類“雜菌”治理常用方法。物理防治主要涉及菌種的選擇、原材料的配比、室內(nèi)外常規(guī)消毒、控制培養(yǎng)溫濕度等；化學(xué)防治主要使用多菌靈、生石灰等粉劑拌料或使用二氯異氰尿酸鈉熏蒸消毒[9-12]。但由于過量化學(xué)農(nóng)藥會(huì)在食用菌產(chǎn)品中有所殘留、影響產(chǎn)品質(zhì)量并且會(huì)危害人體健康[13]。因此，選用高效的生物農(nóng)藥作為替代品，是實(shí)現(xiàn)綠色安全生產(chǎn)的有效措施之一。

植物源農(nóng)藥又稱植物性農(nóng)藥，是指利用植物體內(nèi)參與自身防御反應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物不利于有害生物的特性而開發(fā)利用的藥劑，例如對(duì)昆蟲具有拒食、毒殺、麻醉、抑制生長(zhǎng)發(fā)育及干擾正常行為的，或是對(duì)多種病原菌及雜草具有抑制作用的次生代謝物[14]。植物源農(nóng)藥具有環(huán)境友好、生物活性多樣、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢(shì)[15-16]。截至2019年底，中國(guó)在登記有效期內(nèi)的植物源農(nóng)藥共計(jì)28種，其中苦參堿單劑的登記數(shù)量最多，占農(nóng)用植物源農(nóng)藥品種登記單劑數(shù)量的45%[17]?？鄥A對(duì)人畜低毒，是廣譜殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用[18]，與蛇床子素一樣具有殺蟲和抑菌的雙重作用。前期有研究指出，植物提取物對(duì)木霉(Trichodermaspp.)、青霉(Penicillium)和脈孢霉(Neurospora)等食用菌的競(jìng)爭(zhēng)性雜菌孢子萌發(fā)存在明顯抑制作用[19]，但是關(guān)于植物源農(nóng)藥在食用菌生產(chǎn)中“雜菌”治理應(yīng)用的報(bào)道，十分有限。

本研究從被污染的香菇栽培料中分離并鑒定出脈孢霉菌，選取印楝素、苦參堿、丁子香酚、蛇床子素、乙蒜素5種植物源農(nóng)藥通過藥劑平板法探討其對(duì)脈孢霉菌落生長(zhǎng)的影響，以期為食用菌生產(chǎn)上的生物防治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和藥劑

脈孢霉菌株分離于黑龍江省大慶市春雷農(nóng)場(chǎng)被污染的香菇栽培料，在無菌操作臺(tái)中用消毒接種鉤輕輕刮取發(fā)病部位的霉層，接種到PDA培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；再取邊緣菌絲純化培養(yǎng)，連續(xù)純化兩代后置于4 ℃冰箱保存，備用。

供試5種植物源農(nóng)藥分別為：印楝素，0.3%乳油，農(nóng)藥登記號(hào)PD20101580，成都綠金生物科技有限責(zé)任公司；苦參堿，1.3%水劑，農(nóng)藥登記號(hào)PD20121488，恒源偉業(yè)生物科技；丁子香酚，0.3%可溶液劑，農(nóng)藥登記號(hào)PD20120949，南通神雨綠色藥業(yè)有限公司；蛇床子素，1%水乳劑，農(nóng)藥登記號(hào)PD20150150，內(nèi)蒙古清源寶生物科技有限公司；乙蒜素，80%乳油，農(nóng)藥登記號(hào)PD20101285，河南省大地農(nóng)化有限責(zé)任公司。

1.2 脈孢霉DNA的提取及分子鑒定

將供試脈孢霉接種到PDA液體培養(yǎng)基，28 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)2 d，用吸水紙吸干水分的新鮮菌絲通過CTAB法提取菌絲基因組DNA[20]。然后通過ITS1和ITS4通用引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送華大測(cè)序，并提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)分析。PCR擴(kuò)增及測(cè)序引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。

1.3 脈孢霉溫度響應(yīng)生長(zhǎng)試驗(yàn)

將PDA活化菌株用8 mm打孔器打成大小一致的菌塊，接入90 mm培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中央，分別置于10個(gè)不同溫度梯度下恒溫培養(yǎng)24 h，用十字交叉法測(cè)菌落直徑，設(shè)3個(gè)重復(fù)。溫度梯度分別為5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃，以28 ℃為對(duì)照。

菌絲生長(zhǎng)速度=(菌落半徑-打孔器半徑)/時(shí)間。

1.4 植物源農(nóng)藥抑菌作用測(cè)定

將PDA培養(yǎng)基定量分裝于100 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min，水浴鍋緩慢冷卻至60 ℃時(shí)，分別加入50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍、2 000倍稀釋的供試農(nóng)藥，充分混勻倒入90 mm培養(yǎng)皿中，制成不同濃度的藥劑平板，以清水添加為對(duì)照。

選擇PDA培養(yǎng)基活化菌株用8 mm打孔器制備接種菌碟，接入藥劑平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測(cè)菌落直徑，設(shè)3個(gè)重復(fù)。其中抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-打孔器直徑)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2003軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，運(yùn)用DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件Duncan’s新復(fù)極差法比較不同處理間的差異顯著性，并計(jì)算各供試藥劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r值和EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 脈孢霉的分子鑒定及其菌絲最適生長(zhǎng)溫度

以純化菌株基因組DNA為模板，ITS1和ITS4擴(kuò)增特異PCR產(chǎn)物直接測(cè)序獲得600 bp堿基序列，提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)(表1)，匹配112條錘舌菌綱真菌序列，發(fā)現(xiàn)與好食脈孢霉菌(Neurosporasitophila)株M21的18S核糖體RNA基因序列的完全匹配，期望(Expect)值為0.0、一致性(Identities)為100%、缺口(Gaps)為0%，表明供述菌株為好食脈孢霉(N.sitophila)。將脈孢霉置于10個(gè)不同溫度下培養(yǎng)24 h，不同溫度下菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著(圖1)。在5 ℃和 45 ℃時(shí)停止生長(zhǎng)，在二者區(qū)間內(nèi)均可生長(zhǎng)；在 10 ℃和15 ℃雖能生長(zhǎng)但菌落生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)速率分別為3 mm/d和5.7 mm/d，48 h后菌落直徑變化不大，同時(shí)產(chǎn)生少量橘紅色分生孢子；30 ℃和35 ℃處理及28 ℃對(duì)照培養(yǎng)的脈孢霉在接種24 h后已經(jīng)長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，28～35 ℃為該菌最適生長(zhǎng)溫度區(qū)間；25 ℃和40 ℃下脈孢霉生長(zhǎng)速率相當(dāng)，為28 mm/d左右。結(jié)果表明，脈孢霉生長(zhǎng)溫度范圍較廣、喜高溫，最適生長(zhǎng)溫度為28～35 ℃。

表1 測(cè)序脈孢霉ITS序列比對(duì)結(jié)果Table 1 ITS sequence alignment of the tested Neurospora strain

2.2 印楝素對(duì)脈孢霉菌絲生長(zhǎng)的影響

0.3%印楝素乳油分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍的藥劑平板對(duì)脈孢霉的抑制率差異不同(圖2)。隨處理藥劑濃度的升高，菌落直徑減小，抑制率增強(qiáng)。其中，印楝素乳油2 000倍和1 000倍平板與對(duì)照相同，抑菌率為0；500倍平板抑菌率55%，與對(duì)照差異顯著；100倍和50倍平板(3 mg/kg)抑菌率達(dá)100%，菌絲僅在菌碟上生長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢且為絮狀，48 h后仍有粉紅色孢子產(chǎn)生。

2.3 苦參堿對(duì)脈孢霉菌絲生長(zhǎng)的影響

1.3%苦參堿水劑分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍的藥劑平板對(duì)脈孢霉的抑制率有差異(圖3)。隨藥劑處理濃度的升高，菌落直徑減少，抑制率增強(qiáng)，均與對(duì)照差異顯著。其中，苦參堿水劑2 000倍平板抑菌率為24%，1 000倍(13 mg/kg)抑制率為63%，50倍平板抑菌率近100%。

2.4 丁子香酚對(duì)脈孢霉菌絲生長(zhǎng)的影響

0.3%丁子香酚可溶劑分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍的藥劑平板對(duì)脈孢霉的抑制率相近(圖4)，2 000倍平板(1.5 mg/kg)時(shí)抑制率達(dá)到95%，其余供試濃度藥劑抑菌率均為100%。

2.5 乙蒜素對(duì)脈孢霉菌絲生長(zhǎng)的影響

將80%乙蒜素乳油分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍，供試6個(gè)濃度藥劑平板抑菌率均為100%，與對(duì)照間差異顯著(圖5)。乙蒜素乳油2 000倍濃度(400 mg/kg)抑制效果也相當(dāng)明顯，菌碟上的菌絲在24 h后萎縮 死亡。

2.6 蛇床子素對(duì)脈孢霉菌絲生長(zhǎng)的影響

1%蛇床子素水乳劑分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍的藥劑平板對(duì)脈孢霉的抑制率不同，與對(duì)照差異顯著(圖6)。隨處理藥劑濃度的升高，菌落直徑減小，抑制率增強(qiáng)。其中，蛇床子素水乳劑2 000倍平板抑菌率為63%，500倍(20 mg/kg)及更低倍數(shù)平板抑菌率均超過90%，但在48 h后仍有粉紅色分生孢子產(chǎn)生。

2.7 植物源農(nóng)藥對(duì)脈孢霉的毒力分析

依據(jù)供試農(nóng)藥對(duì)菌絲的抑制數(shù)據(jù)，計(jì)算藥劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和半最大效應(yīng)濃度(EC50)。由表2可見，丁子香酚和乙蒜素對(duì)脈孢霉的抑制作用最強(qiáng)，其回歸曲線相關(guān)系數(shù)和EC50值均為0；其次是印楝素和苦參堿，印楝素回歸曲線的相關(guān)系數(shù)為0.974 4和苦參堿(0.973 5)相差不大，二者的EC50也相差不大；蛇床子素回歸曲線的相關(guān)系數(shù)為0.884 1，其EC50為 5.329 8。供試5種植物源藥劑對(duì)脈孢霉的毒力分別為乙蒜素=丁子香酚>印楝素>苦參堿>蛇床子素。

表2 供試植物源農(nóng)藥對(duì)脈孢霉的毒力Table 2 Toxicity of the tested phytogenic pesticides to Neurospora

3 結(jié)論與討論

按照植保理論，抗性品種的應(yīng)用是最理想的，但是食用菌抗性品種開發(fā)十分有限[21]，所以目前食用菌工廠化生產(chǎn)中病蟲害的防治仍以物理、化學(xué)防治為主。本研究從北方香菇分離鑒定一株脈孢霉屬真菌后，側(cè)重分析5種植物源農(nóng)藥對(duì)脈孢霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。其中丁子香酚和乙蒜素對(duì)其抑制率最高，抑菌效果最好，可用于食用菌生產(chǎn)中脈孢霉的生物防治，或可與前期對(duì)脈孢霉防治化學(xué)藥劑[22-23]相結(jié)合提高防效。丁子香酚注冊(cè)登記為殺菌劑，近來有研究表明丁子香酚可抑制蘋果斑點(diǎn)落葉病菌(Alternariamali)和腐爛病菌(Valsamali)菌絲生長(zhǎng)，用于蘋果病害防治[24-25]，本研究結(jié)果亦表明該單劑具有明顯的廣譜性。也有研究表明，在相等劑量下，大蒜素對(duì)番茄葉霉菌的防治效果高于多菌靈和甲基托布津，表明大蒜素是一種可以替代化學(xué)藥劑防治葉霉病的有效抑菌物質(zhì)[26]，或是與40%福星乳油和70%甲基托布津等化學(xué)農(nóng)藥配合施用防治脈孢霉等真菌危害[27]，并能提高速效性，取得經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益雙豐收。此外，植物源農(nóng)藥中藜蘆堿對(duì)黑腹果蠅卵和幼蟲的生物活性最高，而苦參堿對(duì)成蟲的殺蟲活性高，兩種藥劑在食用菌害蟲防治中均具備較好的應(yīng)用前景[28]，本研究中苦參堿也具有一定的抑菌活性，表明植物源農(nóng)藥具有病、蟲兼防的廣譜性，有助于食用菌減藥增效的綠色產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

已有研究[29]表明，除蟲菊素和印楝素對(duì)平菇(Pleurotusostreatus)菌絲生長(zhǎng)抑制率極低，可安全用于拌料栽培防治平菇害蟲。當(dāng)然也有研究[30]表明，植物源農(nóng)藥對(duì)木耳(Auriculariaauricula)菌絲具有明顯的抑制作用，且抑制率均隨稀釋倍數(shù)的增大而降低，其中印楝素對(duì)木耳菌絲的抑制率最高，苦參堿和除蟲菊素其次。盡管植物源農(nóng)藥應(yīng)用于食用菌生產(chǎn)尚存在一定限制，但是基于經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益綜合考慮，可以充分利用植物源農(nóng)藥對(duì)光不穩(wěn)定和活性成分易分解等弱點(diǎn)[15-16]，探討錯(cuò)期或錯(cuò)環(huán)境應(yīng)用植物源農(nóng)藥。當(dāng)然，食用菌菌絲生長(zhǎng)以及子實(shí)體的形成都極易受外源物的影響，國(guó)家己登記且能夠用在食用菌生產(chǎn)上的殺菌劑較少，本研究試驗(yàn)只限于室內(nèi)，今后可將篩選出的藥劑在生產(chǎn)上進(jìn)行驗(yàn)證并分析食用菌中的藥劑殘留，明確供試藥劑對(duì)食用菌的高效性與安全性。