譚一羅，蘇文英，任立凱，樊繼偉，周振玲，楊和川

(連云港市農業(yè)科學院，江蘇連云港 222000)

羊肚菌別名美味羊肚菌、羊肚子、蜂窩蘑等，是羊肚菌屬(Morchella)真菌的總稱，具有抗腫瘤、保護心血管、增強免疫等藥理學作用。羊肚菌在全球都廣泛分布，但是在人工栽培和生產中面臨著復雜的病蟲害，嚴重影響羊肚菌的產量和品質。土壤微生物對羊肚菌子囊果發(fā)育及病害發(fā)生的機理和影響至今仍不明確，因此，研究羊肚菌根際土壤微生物群落組成對其病害的發(fā)生機理及防控具有重要意義。由于田間環(huán)境復雜，羊肚菌菌塘極易發(fā)生真菌性病害，常見有鐮刀菌屬(Fusarium)引起的爛柄病、Diploosporalongispora引起的霉菌性枯萎病，競爭性雜菌如盤菌屬(Peziza)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、鬼傘屬(Coprinus)等，嚴重影響羊肚菌品質，給羊肚菌栽培者造成經濟損失[1-2]。研究表明，根際微生物能夠幫助植物吸收或利用土壤中的營養(yǎng)物質從而促進植物生長發(fā)育或抵抗病害，此外土壤微生物結構和功能也是土傳病害的重要因素[3-4]。沈洪[5]采用變性梯度凝膠電泳技術研究了云南羊肚菌菌塘土壤的細菌和真菌群落組成，發(fā)現(xiàn)菌塘中盤菌綱(Pezizomycetes)的真菌種類較多，且群落差異較大。張相鋒等[6]采用Biolog-ECO法分析了伊犁不同土層深度的野生羊肚菌根際微生物多樣性，結果表明上層土壤具有更高的多樣性。土壤微生物群落結構對羊肚菌病害發(fā)生具有重要影響，課題組分別從發(fā)生病害的羊肚菌菌柄和菌蓋上分離出1株病原菌，經鑒定均為長毛擬青霉(Paecilomycespenicillatus)，本研究通過對健康羊肚菌和發(fā)生長毛擬青霉病害的羊肚菌根際土壤進行高通量測序，分析栽培羊肚菌后以及羊肚菌感染病害后的真菌群落結構，探究長毛擬青霉病害發(fā)生對土壤真菌群落的影響，為長毛擬青霉和其他土傳病害的發(fā)生、防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

試驗以羊肚菌子實體根際土壤為研究對象，于2020年3月17日隨機采集江蘇省連云港市海州區(qū)長勢良好、健康的梯棱羊肚菌子實體9株，按Cui等[7]方法采集羊肚菌子實體根際土壤，每3株羊肚菌子實體根際土壤均勻混合作為1個樣品，分別編號為Soil1.1、Soil1.2和Soil1.3。同日，按同樣方法采集同一大棚內感染長毛擬青霉的羊肚菌子實體根際土壤，對應樣品編號為Soil2.1、Soil2.2和Soil2.3。采集同一大棚內未栽培羊肚菌地塊的土壤作為對照組，編號CK 0.1、CK0.2和CK0.3。采集的土壤樣品裝入 10 mL無菌離心管，液氮冷凍后于-80 ℃保存，備用。

1.2 DNA提取

1.3 真菌ITS 1區(qū)PCR擴增

利用真菌ITS 1區(qū)進行PCR擴增，上游引物F序列為5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，下游引物R序列為 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。擴增體系(30 μL)：2×Phanta Master Mix 15 μL，上游引物F 1 μL，下游引物R 1 μL，模板DNA 2 μL(20 ng)，ddH2O 11 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，29個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.4 文庫構建及Illumina MiSeq測序

1.5 數(shù)據處理

使用軟件QIIME1.17對序列質量進行質控過濾，軟件UPARSE7.1對OTU按97%相似水平進行聚類，并用UCHIME去除嵌合體序列。OTU分布維恩圖通過VennDiagram繪制，利用軟件Mothur v.1.21.1[8]對各土壤樣品進行Alpha多樣性分析，用R語言工具進行各樣品的主成分分析，并繪制物種組成柱狀圖和聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 測序結果及OTU分析

Illumina高通量測序結果見表1。將測序中的嵌合體序列和單例序列剔除，Soil1組中樣本平均有效序列數(shù)為118 181±5 737，Soil2組中樣本平均有效序列數(shù)為122 023±11 357，CK組中樣本平均有效序列數(shù)為12 3475±9 170。對每個樣品隨機抽取111 079條序列進行抽平，在0.97相似水平下進行聚類，得到每組樣本OTU個數(shù)(圖1)，Soil1、Soil2、CK組各自獨有的OTU數(shù)分別為39、66、44，3組共有OTU數(shù)為175個。

表1 測序數(shù)據和OTU統(tǒng)計Table 1 Sequencing data and OTU statistics

2.2 多樣性分析

土壤樣品的Alpha多樣性結果見表2。3組土壤樣本覆蓋率均達到99.9%以上，說明測序深度較高，基本能覆蓋樣品中所有物種，測序結果可以用于進一步分析。Alpha多樣性結果表明，Soil2的Chao1指數(shù)、物種數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均顯著高于Soil1和CK；Soil1和CK的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)沒有顯著差異，但是CK的物種數(shù)顯著高于Soil1。說明土壤在栽培羊肚菌后真菌多樣性降低，當羊肚菌發(fā)生長毛擬青霉病害后土壤真菌多樣性明顯增加。

表2 土壤樣本Alpha多樣性統(tǒng)計Table 2 Alpha diversity statistics of soil samples

2.3 群落結構分析

3組土壤樣品在不同分類水平上的真菌群落結構如圖2。圖2-A表明子囊菌門(Ascomycota)是土壤樣本的主要類群，其次是擔子菌門(Basidiomycota)；栽培羊肚菌后，土壤擔子菌門比例降低、子囊菌門比例上升，當發(fā)生長毛擬青霉病害后，土壤子囊菌門比例明顯下降。圖2-B表明傘菌綱(Agaricomycetes)和糞殼菌綱(Sordariomycetes)是3組土壤樣品的主要類群，其次還有散囊菌綱(Eurotiomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)等。羊肚菌生長使土壤中傘菌綱比例上升，糞殼菌綱、散囊菌綱、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、盤菌綱比例下降；發(fā)生長毛擬青霉病害后，傘菌綱比例下降，散囊菌綱、座囊菌綱、糞殼菌綱比例上升。

2.4 真菌群落結構聚類分析

樣品物種豐度聚類熱圖(圖3)可以看出，CK組中豐度較高的屬有亡革菌屬(Thanatephorus)、曲霉屬(Aspergillus)、稻瘟菌屬(Magnaporthe)、毛殼菌屬(Chaetomium)、Paramyrothecium、杯梗孢屬(Cyphellophora)和棒孢屬(Corynespora)；Soil1組中豐度較高的屬有亡革菌屬、曲霉屬、稻瘟菌屬、毛殼菌屬和帚枝霉屬(Sarocladium)；Soil2組中豐度較高的屬有曲霉屬、毛殼菌屬、帚枝霉屬、擬青霉屬(Paecilomyces)、枝鼻菌屬(Cladorrhinum)、錐蓋傘屬(Conocybe)、棒孢屬、念珠菌屬(Candida)和枝頂孢霉屬(Acremonium)。結果表明羊肚菌菌絲生長對土壤真菌優(yōu)勢群落存在一定影響，長毛擬青霉病害發(fā)生后其根際優(yōu)勢真菌變化較大，長毛擬青霉豐度升高，同時還富集了更多的真菌群落。

2.5 真菌群落結構的主成分分析

對土壤樣品OTU組成進行主成分分析，以第1、第2主坐標的排序繪制二維聚類圖(圖4)。可以看出，聚類圖將土壤樣本聚為3類，同組樣本OTU組成相似，在聚類圖中分布較近。說明Soil1、Soil2和CK土壤樣本真菌組成存在差異，羊肚菌生長及長毛擬青霉病害均能改變土壤原有真菌群落結構。

3 討 論

近年來，Illumina Miseq測序技術廣泛應用于土壤、腸道等微生物群落結構研究，與傳統(tǒng)方法相比具有高通量、自動化、低成本、快捷等優(yōu)勢[9]。在OTU統(tǒng)計過程中，真菌38%的singletons可能是潛在的假物種，大部分的singletons都能劃分到低水平的分類單元中，即稀有物種，所以去除singletons可能會低估樣品多樣性[10]。本研究考慮到稀有物種在整個群落中的作用較弱，因此去掉所有singletons后進行土壤群落結構的分析。

陳誠等研究表明鐮刀菌感染導致的羊肚菌爛柄病發(fā)生會導致擬青霉屬真菌的富集，其發(fā)病子實體根際中曲霉屬、擬青霉屬、木霉屬等真菌豐度較高[11]，該結果與本研究基本一致，本研究在感染長毛擬青霉羊肚菌的根際也檢測到了鐮刀菌屬，推測這些病原真菌共同作用導致菌塘病害發(fā)生。張婷等研究表明羊肚菌土壤真菌優(yōu)勢類群為盤菌綱、壺菌綱(Chytridiomycetes)、接合菌綱(Zygomycota)、糞殼菌綱、座囊菌綱和散囊菌綱，與本研究中的優(yōu)勢類群大多數(shù)一致[12]。沈洪等[13]通過真菌28S rDNA基因信息比較了羊肚菌菌塘土壤的微生物多樣性，研究共測得了12種真菌，其中盤菌綱10種，異擔子菌綱1種，未知1種，且僅羊肚菌菌塘土壤能檢測出羊肚菌。本研究中羊肚菌根際土壤樣品均可檢測到羊肚菌屬，未生長羊肚菌的對照土樣檢測不到羊肚菌屬或豐度極低，推測可能是由于對照土樣與試驗組處于同一大棚內，因此個別樣品檢測到了極低豐度的羊肚菌。

由于羊肚菌菌絲和菌塘中其他真菌存在競爭關系，健康羊肚菌基腳土中羊肚菌菌絲占優(yōu)勢地位，各種雜菌占劣勢地位，所以羊肚菌栽培后土壤真菌多樣性降低，子囊菌門比例上升、擔子菌門比例下降，糞殼菌綱、散囊菌綱等雜菌較對照土樣比例下降；而長毛擬青霉病害發(fā)生后富集了更多的競爭性雜菌，羊肚菌菌絲生長受到抑制，加之氣溫回升導致菌塘中青曲、霉等雜菌大量發(fā)生，所以土壤真菌多樣性增加，子囊菌門比例下降，散囊菌綱等雜菌比例上升。栽培羊肚菌土壤中傘菌綱比例較高推測是菌塘中常伴生鬼傘屬等競爭性雜菌導致。本研究通過Illumina Miseq平臺測序和分析，在3組試驗土壤樣品中均檢測到了擬青霉屬真菌，且發(fā)生病害組土壤樣品的擬青霉屬、枝頂孢霉屬、棒孢屬等真菌豐度升高，說明在病害發(fā)生過程中發(fā)生了富集。因此，在羊肚菌栽培前抑制擬青霉屬、棒孢屬、鐮刀菌屬等羊肚菌病原菌群，維持合理的土壤真菌結構，對羊肚菌生產具有重要意義。