謝久鳳， 張寒蕾， 閆睢豪， 郭陽陽， 楊亞昕， 李海霞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

費菜又稱土三七、景天三七，是景天科景天屬多年生草本植物，含有豐富的黃酮類、生物堿、氨基酸、谷甾醇、維生素以及多種糖類物質(zhì)，且作為食物口感極佳，具有極高的觀賞價值、藥用價值及食用價值[1-2]。費菜富含的黃酮類物質(zhì)具有抗炎、抗氧化、抗病毒、改善記憶、調(diào)節(jié)血管滲透性、防治慢性疾病、保護(hù)DNA及抑制腫瘤細(xì)胞生長等功效，具有很高的藥用價值[3-5]。市場對費菜的需求量很大，而傳統(tǒng)的扦插和分株繁殖方式較難實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。關(guān)于費菜葉片組織培養(yǎng)目前鮮見報道，繁殖以扦插和分株為主，但易受季節(jié)和外界環(huán)境的影響，存在繁殖系數(shù)低、幼苗質(zhì)量差和生根難的問題，嚴(yán)重制約著大規(guī)模的種植。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可解決繁殖難問題，本試驗以費菜葉片為外植體進(jìn)行再生培養(yǎng)，建立組培快繁體系，以滿足市場需求。

1 材料與方法

1.1 材料

費菜采購于鄭州市陳寨花卉市場，均為健康植株。植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA，NAA，以75%乙醇、氯化汞進(jìn)行材料消毒。

1.2 方法

采集新鮮的費菜嫩葉片→自來水加入洗潔精進(jìn)行清洗→自來水沖洗5 min→蒸餾水浸泡5 min→超凈臺無菌環(huán)境中用75%乙醇浸泡10 s→無菌水清洗4～5次→0.1%氯化汞浸泡3～5 min→無菌水沖洗4～5次→無菌濾紙吸干水分備用。

1.2.2 培養(yǎng)基配制

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制不同培養(yǎng)基。

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。設(shè)6個處理，T1～T3分別為6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1、0.2、0.3 mg·L-1；T4～T6分別為6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1、0.2、0.3 mg·L-1。

叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。設(shè)6個處理，M1～M3分別為6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2、0.4、0.6 mg·L-1；M4～M6分別為6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2、0.4、0.6 mg·L-1。

壯苗培養(yǎng)基。MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

生根培養(yǎng)基。1/2MS+NAA 0.1 mg·L-1。

以上培養(yǎng)基pH值為5.8，于115 ℃下滅菌30 min，倒入無菌組培瓶中，每瓶20～25 mL(生根培養(yǎng)基每瓶倒30 mL)。

5.3 去雄。為節(jié)省養(yǎng)分，將有限的養(yǎng)分集中供給植株生長發(fā)育，因此，玉米拔除多余分蘗應(yīng)及早進(jìn)行，以降低養(yǎng)分損耗，同時還可以避免損傷主莖。玉米去雄可減少植株體內(nèi)的營養(yǎng)消耗，促使光合產(chǎn)物和礦物營養(yǎng)向雌穗輸送，使穗大、粒多、子飽。去雄后，一般可增產(chǎn)10%左右。人工輔助授粉可減少禿頂、缺粒，一般可增產(chǎn)8%～10%。在玉米進(jìn)入蠟熟末期，扒開玉米果穗苞葉，以促進(jìn)玉米早熟，進(jìn)行田間降水，提高玉米品質(zhì)。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

在無菌環(huán)境下用刀片和鑷子將葉片切成直徑1～2 cm的小塊，背面朝上平整放入組培瓶的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶放3～4塊，每個濃度做20瓶，最后將組培瓶放入人工氣候培養(yǎng)箱中，23 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后打開燈光，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照培養(yǎng)12 h，第10和20天時觀察愈傷組織生長情況，30 d后統(tǒng)計愈傷組織生長結(jié)果，計算不同激素濃度配比下愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.4 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

選取上述最佳的配比處理的松軟、綠色、生長狀態(tài)好的外植體，切成0.5 cm見方小塊，轉(zhuǎn)移至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每種濃度轉(zhuǎn)接10瓶，每瓶轉(zhuǎn)接4～5塊外植體。在人工氣候培養(yǎng)箱中23 ℃、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，每天光照12 h培養(yǎng)。在培養(yǎng)10和20 d后觀察叢生芽的生長情況，30 d時計算出芽率。

1.2.5 壯苗和生根培養(yǎng)

將獲得的叢生芽切割成單芽，接種到壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，光照12 h、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx、23 ℃培養(yǎng)20～25 d后，選取生長高度4～6 cm、具有3～4片葉的幼苗，將其從基部切下，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.6 煉苗與移栽

生根培養(yǎng)10～20 d后，當(dāng)組培苗長出5～6片葉、7～8條根時，將組培瓶從人工氣候培養(yǎng)箱中取出，放置陽光能照射的外界環(huán)境中適應(yīng)3～4 d，然后取下瓶蓋煉苗3～4 d，往瓶中加入溫水溶解培養(yǎng)基，用鑷子輕輕取出小苗，用清水洗凈根部黏附的瓊脂，待晾干后栽入經(jīng)滅菌處理的草炭土、蛭石、珍珠巖等體積混合基質(zhì)中，并計算成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

由圖1可見，接種10 d后，在外植體切口處萌發(fā)出半透明狀的綠色水珠樣的微小胚狀體，隨后從胚狀體中央抽出帶絨毛的小芽，分化出具有胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而生長成完整的小植株，25 d時統(tǒng)計誘導(dǎo)情況。由表1可知，T2的胚狀體生長狀態(tài)最好，芽體濃綠，出芽量多，健壯緊湊，故T2培養(yǎng)基是費菜愈傷組織誘導(dǎo)最適合的培養(yǎng)基。

圖1 費菜胚狀體生長情況

表1 不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果

由圖2可知，費菜胚狀體誘導(dǎo)芽培養(yǎng)至第10天時，叢生芽大量生長，逐漸形成完整植株，25 d時已經(jīng)完全長成小植株。由表2可知，M3培養(yǎng)基誘導(dǎo)率為100%，叢生芽量多，苗健壯，生長旺盛，葉片濃綠，是費菜叢生芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基。

圖2 費菜叢生芽誘導(dǎo)情況

表2 不同培養(yǎng)基對叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.3 壯苗和生根培養(yǎng)

選取生長最佳的費菜叢生芽，將其從基部切割，轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。由圖3可見，培養(yǎng)20 d時，株高達(dá)4～5 cm，葉片濃密。將單個幼苗從基部切割轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10 d后觀察發(fā)現(xiàn)，幼苗基部開始形成10條左右細(xì)根；繼續(xù)培養(yǎng)至第20天，每個幼苗下形成大量細(xì)根和須根，生根率達(dá)100%。

圖3 費菜壯苗培養(yǎng)與生根培養(yǎng)

2.4 煉苗與移栽

生根培養(yǎng)20 d后，將組培瓶從人工氣候培養(yǎng)箱中取出，置于外界環(huán)境中適應(yīng)4 d，然后取下瓶蓋煉苗4 d，并往組培瓶中加入溫水溶解培養(yǎng)基，用鑷子輕輕取出小苗，用清水洗凈根部黏附的瓊脂，待晾干后栽入經(jīng)滅菌處理過的草炭土、蛭石、珍珠巖等體積比的混合基質(zhì)中。培養(yǎng)30 d后，費菜成活率達(dá)90%。

3 小結(jié)與討論

有研究選用費菜莖段進(jìn)行離體快繁研究。羅林會等[6]以費菜莖段為材料，以MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.03 mg·L-1作為芽增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基；何碧株等[7]以費菜的莖段進(jìn)行離體快繁，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1，芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。本研究得出，費菜葉片愈傷組織誘導(dǎo)最適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，叢生芽誘導(dǎo)最適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1，壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg·L-1。

費菜組培不是分化出愈傷組織，而是半透明狀的胚狀體形成微小綠水珠狀結(jié)構(gòu)堆積在一起，即由愈傷組織中的薄壁細(xì)胞不經(jīng)過有性生殖過程，直接產(chǎn)生類似于胚的結(jié)構(gòu)；繼續(xù)分化時，會從胚狀體中央抽出帶絨毛的小芽，進(jìn)而發(fā)育成小植株。愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式主要有不定芽方式和胚狀體2種，胚狀體方式比不定芽方式有更多的優(yōu)點，如胚狀體產(chǎn)生的數(shù)量比不定芽多，因其可直接生長成小植株，成苗率較高。由于胚狀體的維管束是獨立產(chǎn)生的，與母體維管束不相連，因此，可得到無病毒植株。費菜的常規(guī)繁殖系數(shù)低，生長緩慢。本試驗的組織培養(yǎng)技術(shù)可在短期內(nèi)獲得大量試管苗，生長迅速，性狀優(yōu)良，且移栽成活率高，可實現(xiàn)費菜規(guī)模化生產(chǎn)。