韋 環(huán)，劉珈玲，廖 強

（廣西-東盟食品檢驗檢測中心，廣西南寧 530021）

我國《蜜蜂產(chǎn)品術語》（GB/T 20573-2006）對蜂蜜的定義為：是蜜蜂采集植物的花蜜，蜜露等分泌物，與自身分泌物結合后在巢脾內經(jīng)過充分釀造而成的天然甜物質。不僅口感香甜，且具有潤肺止咳、潤腸通便、清熱解毒等功效[1?2]，因此深受人們的喜愛。蜂蜜本無毒，但在生產(chǎn)過程中被污染或蜜蜂采集有毒花蜜釀制而成的蜂蜜可能會引起中毒。尤其野生蜂蜜是食物中毒事件的主要致病因子之一[3?4]。建國以來廣西、云南、貴州、福建多地都相繼報道了食用野生蜂蜜中毒事件[5?7]。食用有毒蜂蜜后會引發(fā)一系列的中毒癥狀，如惡心、嘔吐、腹瀉、四肢麻木、血壓下降、呼吸中樞麻痹等，嚴重將引發(fā)休克甚至死亡[4,6,8]，且中毒程度及癥狀與蜂蜜所含的毒素種類和含量密切相關。有毒蜂蜜中所含毒素主要來源于蜜蜂采集了有毒源性的植物花粉，如斷腸草、雷公藤和狼毒等[6,8?10]；雷公藤、斷腸草、洋金花、烏頭、千里光等所含毒性物質主要為生物堿和萜類化合物，如烏頭中的二萜類生物堿：烏頭堿[11]；博落回中的異喹啉類生物堿：小檗堿、原阿片堿和別隱品堿[12]；菊科（如千里光屬和澤蘭屬）中的吡咯里西啶類生物堿：千里光寧堿、千里光菲林生物堿、倒千里光堿[10,13]；胡蔓藤屬中的吲哚類生物堿：鉤吻堿、鉤吻素已、胡蔓藤堿丙、胡蔓藤堿丁[14]；馬桑屬中的萜類化合物馬桑亭[15]等。

《食品安全國家標準 蜂蜜》（GB 14963-2011）中明確規(guī)定“蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露應安全無毒，不得來源于雷公藤、博落回、狼毒等有毒蜜源植物?！钡⑽戳谐鼍唧w植物源毒性成分和相關檢測方法。目前國內對植物中相關毒性物質的檢測方法主要有液相色譜法[16?17]、氣相色譜法[18]、酶聯(lián)免疫吸附分析[19?20]、薄層層析測定法[21?22]、氣相色譜-質譜法[23?25]、液相色譜-質譜法[15?16,26?28]等。液相色譜法檢測靈敏度較低，適合于含量較高的樣品如中草藥；酶聯(lián)免疫吸附分析法酶活性易損失、無法對各類成分進行準確定量分析；氣相色譜-質譜法及液相色譜-質譜法均可實現(xiàn)微量衡量同時多組分分析，是目前司法鑒定主要方法，但氣相色譜-質譜法不適用于熱不穩(wěn)性及高沸點化合物，液相色譜-質譜法可有效解決這樣難題，但傳統(tǒng)的三重四極桿質譜需要標準物質實現(xiàn)定性確證。高分辨質譜儀可依據(jù)其高質量準確度、高質量分辨率的全掃描數(shù)據(jù)在不需要標準物質的情況下實現(xiàn)定性確證，在食品定向和非定向篩查中應用廣泛。

目前我國關于蜂蜜的質量安全研究多以獸藥殘留[29]、農(nóng)藥殘留[30]、重金屬[31]和真?zhèn)舞b別[32?33]為主，對于蜂蜜中植物源性毒性成分的研究甚少，僅有少數(shù)對有毒蜜源性植物雷公藤、昆明山海棠和博落回中毒性成分及其分析方法進行了報道[6,10,34?35]，但是研究成分單一，各方法相對獨立且選擇性差、定性能力弱。食物中毒作為突發(fā)公共衛(wèi)生事件，往往需要在短時間內查明中毒原因，對于行蹤不定的野生蜜蜂其蜜源難以通過其行蹤來推斷其蜜源植物。因此，迫切需要建立蜂蜜中植物源性多種毒性物質的快速篩查方法。四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質譜儀（QExactive）具有良好的定性分析和高分辨率的特點，在單個分析周期內即可完成對樣品高通量、高精度的一級、二級掃描，為化合物的準確鑒定提供了客觀依據(jù)。

本研究以固相萃取法純化樣品，應用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質譜聯(lián)用技術，建立蜂蜜中20 種植物源毒性成分的快速篩查和測定方法，基于高分辨質譜的精準分子量和多級碎片信息確立了20 種植物源毒性成分的質譜數(shù)據(jù)庫。該方法快速、準確、通量高，為進一步開展蜂蜜溯源，安全性評價和監(jiān)測評估食用蜂蜜中毒提供參考，保障了蜂蜜的食用安全和提升了質量控制水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準物質野百合堿（CAS：315-22-0，純度99.48%）、鉤吻堿（CAS：509-15-9，純度98.19%）、東莨菪堿氫溴酸鹽（CAS：114-49-8，純度98.7%）、倒千里光堿（CAS：480-54-6，純度98.02%）、鉤吻素子（CAS：1358-76-5，純度98.34%）、千里光寧（CAS：130-01-8，純度99.48%）、鉤吻堿己（CAS：82354-38-9，純度99.53%）、馬桑亭（CAS：91653-75-7，純度98.96%）、鬧羊花毒素II（CAS: 26116-89-2，純度99.79%）、鬧羊花毒素V（CAS：37720-86-8，純度99.82%）、原阿片堿（CAS：130-86-9，純度99.56%）、A-別隱品堿（CAS：485-91-6，純度98.58%）、次烏頭堿（CAS：6900-87-4，純度99.04%）、烏頭堿（CAS：302-27-2，純度98.52%） 美國斯坦?；瘜W公司；春千里光堿（CAS：72755-25-0，純度99.72%）、春千里光堿N 氧化物（CAS：101687-28-9，純度99.87%）、N-氧化芝麻菜葉千里光（CAS：123864-94-8，純度99.35%）、胡蔓藤堿乙（CAS：82375-29-9，純度98%）

德國PhytoLab 公司；千里光菲靈堿（CAS：480-81-9，純度99.53%） 成都德思特生物技術有限公司；鬧羊花毒素III（CAS：26342-66-5，純度98.6%） 上海源業(yè)生物科技有限公司）；SPE 小柱：混合型陽離子交換固相萃取小柱（MCX，60 mg，3 cc） 美國沃特斯有限公司；甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純，德國默克公司；其余 均為分析純；實驗用樣品為蜜博士百花蜂蜜（批號20190115） 廣西蜜博士蜂業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，經(jīng)預檢驗樣品中不含有上述20 種化合物），其余66 批均購于廣西南寧、崇左、貴港、來賓、欽州等地農(nóng)貿(mào)市場或蜜蜂養(yǎng)植基地。

Ultimate 3000 超高效液相色譜儀-Q-Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司；XS205 DU 電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Multi Reax 全自動振蕩儀德國Heidolph 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確稱取野百合堿、鉤吻堿、東莨菪堿氫溴酸鹽、倒千里光堿、鉤吻素子、千里光寧、鉤吻堿己、馬桑亭、鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III、鬧羊花毒素V、原阿片堿、別隱品堿、次烏頭堿、烏頭堿、春千里光堿、春千里光堿N 氧化物、N-氧化芝麻菜葉千里光、胡蔓藤堿乙、千里光菲靈堿等20 種標準物質各約10 mg（精確至0.1 mg），分別置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成約1.0 mg/mL 的標準儲備溶液。分別精密量取各標準儲備溶液1 mL，置于同一100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，得到10 μg/mL 混合標準中間溶液。

1.2.2 樣品處理 稱取1 g（精確至0.01 g）樣品，置于15 mL 聚丙烯離心管中，加入水5 mL，振蕩使溶解，將所有溶液通過混合型陽離子交換固相萃取小柱使用前依次用5 mL 甲醇、5 mL 水活化）中，棄去洗脫液，然后用10 mL 水淋洗小柱，棄去，再用9 mL 5%氨化甲醇進行洗脫，收集洗脫液至10 mL 容量瓶中，使用5%氨化甲醇定容，混勻后經(jīng)0.22 μm 有機相濾膜過濾，即得。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 液相條件 色譜柱：Thermo GOLD AQC18柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱溫：30 ℃；進樣體積：2 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：A 為含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸銨溶液，B 為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序：0.0～5.0 min，5%～20% B；5.0～10.0 min，20%～45% B；10.0～13.0 min，45%～90% B；13.0～14.0 min，90 % B；14.0～15.0 min，90%～5% B；15.0～20.0 min，5% B。

1.2.3.2 質譜條件 離子源采用HESI 源（heated ESI），噴霧電壓為3.5 kV（+）/3.0 kV（?），透鏡電壓為50 V，離子傳輸管溫度：320 °C，鞘氣流量：35 arb；輔助氣體流量：10 arb；輔助氣溫度：300 °C。掃描方式：采用正、負離子同時掃描，采集模式：Full MS/dd-MS2模式，其中一級全掃描的分辨率：70000 FWHM，掃描范圍：m/z 50～1200，自動增益（AGC）：3×106，最大駐留時間：100 ms；二級掃描分辨率：17500 FWHM，自動增益（AGC）：2×105，最大駐留時間: 50 ms；質荷比窗口寬度（Isolation Window）：m/z 2.0；頂點激發(fā)（Apex tigger）：4～8 s；排除同位素峰（Exclude isotopes）設為“on”，動態(tài)排除（Dynamic Exclusion）設為6.0 s，歸一化碰撞能量（NCE）為20%、40%、60%。20 種物質其他條件詳見表1。

1.3 數(shù)據(jù)庫的建立

精取“1.2.1”標準使用液1.0 mL，置于100 mL 容量瓶中用甲醇定容至刻度；按“1.2.3”條件進樣，將得到的高分辨質譜數(shù)據(jù)通過Xcalibar 軟件得到目標物的準確質量數(shù)、保留時間、二級碎片離子等信息，將信息輸入到篩查軟件TraceFinder 下，建立質譜數(shù)據(jù)庫（Compound Database）。

1.4 定量檢測

本實驗采用Full MS/dd-MS2 模式，選擇母離子（見表1）進行外標法定量。

表1 20 種植物源性毒性成分的分子式、保留時間、精確質量數(shù)、質量數(shù)偏差及主要二級離子Table 1 Molecular formula, retention time, precise mass number, mass number deviation and main secondary ion mass number of 20 plant-derived toxic

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于本次實驗20 種化合物來源于多種植物，且大部分為生物堿類成分，極性差異較大。故本實驗分別考察了Thermo GOLD AQ-C18、Agilent HILIC（150 mm×2.1 mm，3 μm）、ACE Excel2 C18-PFP（150 mm×2.1 mm，3 μm）三種類型的色譜柱，結果Thermo GOLD AQ-C18在20 種化合物中分離效果和峰形最佳；在流動相的考察中，結果發(fā)現(xiàn)乙腈離子化能力強于甲醇，且基線噪音較低；0.1%甲酸乙腈能有效改善峰形及離子化效果，故選0.1%甲酸乙腈作為有機相；水相中加入0.1%甲酸后離子化效率、化合物響應值更高；加入10 mmol/L 甲酸銨后能兼顧負離子掃描時也得到較好的響應，故最終0.1%甲酸（含10 mmol/L 甲酸銨）作為水相流動相。

2.2 質譜條件優(yōu)化

2.2.1 質譜參數(shù)的優(yōu)化 本實驗使用了Full MS/dd-MS2采集模式，該模式首先進行一級全掃描，然后對指定的前級離子做進一步的二級掃描。在實驗室中，對一級全掃描的質譜參數(shù)先后考察了35000、70000及140000 的分辨率對質譜信號的影響，結果顯示使用140000 的分辨率一級離子的靈敏度會顯著降低，這可能是由于過高的分辨率會顯著降低掃描速度，造成一級掃描點數(shù)不足，造成色譜峰形變差，影響分析，故選擇了一級質譜掃描采用70000 的分辨率。

2.2.2 物質電離方式的優(yōu)化 在1.2.3 質譜條件下，鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III 易發(fā)生離子源內裂解，鬧羊花毒素II m/z=410.22990 考慮到其結構可能在離子源內裂解失去-C2H3O2, 形成了穩(wěn)定的雙鍵得到m/z=297.18439（見圖1）；鬧羊花毒素III m/z=329.19587 在離子源內裂解失去4 個H2O 后形成了穩(wěn)定的雙鍵，得到m/z=297.18439（見圖2）。鬧羊花毒素V[M+H]+電離模式下沒有加氫峰，而在[M+Na]+電離模式下有極強的加鈉峰；馬桑亭在[M-H]?電離模式下能得到很好的減氫峰，其它17 種植物源性毒性成分在[M+H]+電離模式下均能得到很好的加氫峰。

圖1 鬧羊花毒素II 的裂解圖Fig.1 Chinese azalea flowers toxins II cracking figure

圖2 鬧羊花毒素IIII 的裂解圖Fig.2 Chinese azalea flowers toxins IIII cracking figure

2.3 固相萃取小柱的選擇

由于20 種植物源性毒性成分多數(shù)生物堿等堿性物質，故本實驗選擇了混合型陽離子交換固相萃取小柱（MCX）、混合型弱陽離子交換固相萃取小柱（PCX）、Waters Oasis HLB 三種類型對生物堿有效好保留的固相萃取小柱進行前處理考察。結果發(fā)現(xiàn)混合型陽離子交換固相萃取小柱（MCX）對20 種植物源性毒性成分具有高的選擇性和靈敏度，均獲得了很好的凈化效果；而Waters Oasis HLB 對千里光菲靈堿的保留較差，回收率只有62.81%；從圖3 中能看出 PCX 對鉤吻堿、千里光菲靈堿、鉤吻素子、千里光寧（千里光堿）、春千里光堿、鉤吻堿己、原阿片堿、胡蔓藤堿乙、別隱品堿、次烏頭堿、烏頭堿保留較差，回收率都無法滿足實驗要求；故首選了Waters Oasis MCX 混合型陽離子交換固相萃取小柱進行樣品提取凈化。

圖3 20 種植物源性毒性成分過不同萃取小柱的回收率Fig.3 Recovery rate of 20 plant-derived toxic ingredients through different extraction column

2.4 凈化方法的優(yōu)化

2.4.1 淋洗溶劑的優(yōu)化 蜂蜜屬于高復雜度過飽和混合物，而糖類作為其主要化學成分，占蜂蜜干物質的95%左右，其中葡萄糖和果糖含量最高，蔗糖其次[36]。在淋洗溶劑的選擇上，對甲醇和水進行考察,結果發(fā)現(xiàn)使用甲醇進行淋洗會導致馬桑亭、鬧羊花毒素V、鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III 等成分跟隨淋洗液共流出，使得回收率降低。而水對糖類物質溶解性較好，且用水淋洗時目標成分隨淋洗液共流出較少，故洗擇水作為淋洗液。進而對淋洗溶劑的量進行了考察，分別考察了使用5、10、15 mL 水進行淋洗，結果發(fā)現(xiàn)15 mL 水洗脫會導致雷公藤乙素回收降低10%左右，10 mL 水能夠將糖類物質洗脫完全，且目標成分獲得較好的回收，回收率結果均大于70%

2.4.2 洗脫溶劑的優(yōu)化 因目標成分均為生物堿類物質，在堿性條件下較易洗脫，故選擇5%氨化甲醇作為洗脫溶劑。分別考察了5、9、15 mL 5%氨化甲醇3 種洗脫劑對目標分析物的影響，綜合考慮目標分析物的洗脫效果和節(jié)省溶劑等因素，最后選擇9 mL 5%氨化甲醇作為洗脫溶劑，能夠達到最佳洗脫效果。

2.5 基質效應的影響

基質效應普遍存在于質譜檢測中，表現(xiàn)為離子增強效應或離子抑制效應，從而導致定量結果有一定的偏差。通?；|效應消除方法有固相萃取凈化、同位素內標法、稀釋法等[37]，而通過對比基質匹配標液與相同濃度的純溶劑標液的儀器響應值來考察基質效應，計算公式為基質效應=基質匹配標液響應值/純溶劑標液響應值，若兩者比值在85%～115%，則基質效應可忽略[38]。本實驗采用固相萃取凈化的方法來消除基質效應的影響，如圖4 所示，經(jīng)過MCX凈化之后，兩者比值在85%～115%之間，其基質效應得到有效消除。因此，本文采用甲醇配制標準曲線，外標法定量。

圖4 20 種植物源性毒性成分的基質效應Fig.4 The matrix effects of 20 plant-derived toxic ingredients

2.6 數(shù)據(jù)庫的篩查

通過TraceFinder 軟件建立的數(shù)據(jù)庫與樣品的保留時間、主要二級碎片、同位素分布和二級質譜圖相識度比對等多種方法，綜合判斷，以得到準確定性結果，避免假陽性檢測結果的出現(xiàn)。實現(xiàn)多組分無對照同時篩查的定性分析。具體分析物質的準確質量數(shù)及碎片離子、保留時間、電離模式如表1 所示；20 種植物源性毒性成分的提取離子流色譜圖見圖5。

圖5 20 種植物源性毒性成分的提取離子流色譜圖Fig.5 Extracted ion flow chromatograms of 20 plant-derived toxic ingredients

2.7 線性關系考察

分別精密吸取“1.2.1”項下溶液0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mL 至10 mL 容量瓶中，使用甲醇溶液稀釋成濃度約為10.0、20.0、50. 0、100. 0、200.0 μg /L的標準工作溶液。按1.2.3 方法測定。用外標法定量，以峰面積為縱坐標（y）、質量濃度為橫坐標（x，μg/L）進行線性回歸，求得回歸方程。再分別吸取“1.2.1”溶液，逐步稀釋，按照“1.2.3”色譜條件測定；取信噪比為3:1 的質量濃度為檢出限，詳見表2，結果表明20 種待測化合物在各自范圍內呈良好的線性關系，r均大于0.995。

表2 20 種植物源性毒性成分的線性及相關系數(shù)和檢出限Table 2 Linearities and correlation coefficients and detection limits of 20 plant-derived toxic ingredients

2.8 精密度試驗

精密吸取“1.2.1”項下對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，結果測得20 種化合物峰面積的RSD 范圍在0.5%～2.3%之間，表明儀器精密度良好。

2.9 重復性試驗

分別稱取1.00 g 樣品六份，置于15 mL 聚丙烯具塞離心管中，分別添加0.02 mL 的混合標準中間溶液（加入量約200 ng），按“1.2.2”項下制備并依法測定。結果測得野百合堿、鉤吻堿、東莨菪堿氫溴酸鹽、倒千里光堿、鉤吻素子、千里光寧、鉤吻堿己、馬桑亭、鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III、鬧羊花毒素V、原阿片堿、A-別隱品堿、次烏頭堿、烏頭堿、春千里光堿、春千里光堿N 氧化物、N-氧化芝麻菜葉千里光、胡蔓藤堿乙、千里光菲靈堿的RSD 分別為0.8%、 1.3%、 1.6%、 1.1%、 0.8%、 1.9%、 2.1%、1.4%、 0.8%、 0.6%、 1.3%、 0.7%、 0.5%、 2.4%、1.8%、1.6%、1.1%、0.5%、1.8%、2.0%，表明方法重復性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗

取“1.2.2”項下同一樣品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12 和24 h 按“1.2.3”色譜條件進樣，記錄相應的色譜峰面積，結果樣品中20 種峰面積的RSD 范圍在0.8%～2.1%之間，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.11 加標回收率試驗

分別稱取1.00 g 樣品18 份，置于15 mL 聚丙烯具塞離心管中，分別添加0.01、0.02、0.1 mL 的混合標準中間溶液各6 份，按“1.2.2”操作，進行低、中、高3 個濃度水平的加標回收試驗，按1.2.3操作進樣分析，計算加樣回收率（結果見表3）；結果如表所示各植物源性毒性成分回收率介于74.1%～114.6%之間，表明本檢測方法的準確度高，可滿足實驗室的日常分析需求。

表3 20 種植物源性毒性成分的平均回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Aaverage recoveries and relative standard deviations of 20 kinds of plant-derived toxic ingredients (n = 6)

2.12 實際樣品分析

按“1.2”方法將66 批蜂蜜樣品進行測定，結果發(fā)現(xiàn)在8 批蜂蜜樣品中檢出東莨菪堿，含量在20～1400 μg/kg 之間；其中2 批蜂蜜中另檢出倒千里光堿，含量在48～150 μg/kg 之間；2 批蜂蜜中檢出N-氧化千里光菲靈堿含量在49～80 μg/kg 之間，詳情見表4，結果表明，在蜂蜜中檢出有毒化合物占12%，在蜂蜜中存在一定的食品安全風險。

表4 樣品測定結果（μg/kg）Table 4 Results of random test (μg/kg)

3 結論

本研究建立了以純水提取，混合型陽離子交換固相萃取小柱（MCX）凈化，結合超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法對蜂蜜中的20 種植物源性毒性成分進行測定，其中檢出了東莨菪堿、倒千里光堿和N-氧化千里光菲靈堿，提示食用蜂蜜還是存在一定的食品安全風險。方法的準確度和精密度結果都符合要求，證明該方法在對蜂蜜進行20 種植物源性毒性成分的定性定量分析時提供可靠、重復、并且準確的結果；滿足日常檢測和風險篩查要求。