周靜萍，劉 偉，楊春燕，殷 昊，盧 珂

（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300131）

隨著食品安全問題的日益加劇，天然、安全的生物防腐劑備受人們的青睞。乳鏈菌肽（C143H228N42O37S7，Nisin），是由乳酸鏈球菌亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）中某些菌株分泌的一種羊毛硫細(xì)菌素，是目前聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）唯一批準(zhǔn)使用的天然食品防腐劑[1]。Nisin 能夠強(qiáng)烈抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，并有效阻止孢子萌發(fā)及毒素的形成[2]。但由于Nisin 的發(fā)酵生產(chǎn)存在產(chǎn)能不足、產(chǎn)率低、碳源成本高等問題，嚴(yán)重制約了Nisin 的工業(yè)應(yīng)用[3]。

近年來，國(guó)內(nèi)外研究者在Nisin 高產(chǎn)菌株選育[4]、培養(yǎng)基優(yōu)化[5]、發(fā)酵條件控制[6]及發(fā)酵方式開發(fā)[7]等方面進(jìn)行了大量研究。例如：高艷飛等[8]以葡萄糖部分替代蔗糖優(yōu)化Nisin 發(fā)酵培養(yǎng)基，大幅降低碳源成本的同時(shí)，Nisin 效價(jià)達(dá)到了以蔗糖為單一碳源的水平。Subha 等[9]將乳酸鏈球菌包埋于海藻酸鈉膠粒中，并將其用于連續(xù)發(fā)酵，Nisin 產(chǎn)量較分批發(fā)酵提高了4 倍。然而，以上研究并沒有解決發(fā)酵過程中Nisin 對(duì)產(chǎn)生菌生長(zhǎng)及自身合成的反饋抑制問題[10]。酸性條件下，Nisin 分子通過靜電作用吸附在產(chǎn)生菌細(xì)胞膜表面，其疏水側(cè)鏈插入到膜內(nèi)并與磷脂結(jié)合，使細(xì)胞膜發(fā)生去極化，小分子代謝物（如氨基酸、ATP 等）快速外泄造成膜內(nèi)外能差消失，引起細(xì)胞自溶[11]。因此，發(fā)酵過程中及時(shí)移除Nisin 對(duì)于進(jìn)一步提高產(chǎn)量具有重要意義。

Nisin 的分離方法主要有鹽析法、凝膠過濾色譜法、樹脂吸附法和水相兩相法[12?15]等。但上述方法很難與發(fā)酵過程耦合，實(shí)現(xiàn)原位分離Nisin。泡沫分離是一種以氣泡為介質(zhì)的界面吸附分離技術(shù)，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作條件溫和、易放大和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。近年來，泡沫分離技術(shù)與微生物發(fā)酵過程耦合強(qiáng)化生物表面活性素（如鼠李糖脂和脂肽）生產(chǎn)引起了研究者們的廣泛興趣[16?17]。但發(fā)酵-泡沫分離耦合技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)Nisin 面臨著以下技術(shù)瓶頸：（1）泡沫分離能夠有效富集Nisin，但副產(chǎn)物乳酸的大量積累導(dǎo)致發(fā)酵液pH 降低，酸脅迫會(huì)增強(qiáng)H+-ATPase 活性，從而抑制菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖[18]；（2）泡沫對(duì)菌體細(xì)胞具有夾帶作用，且氣泡聚并產(chǎn)生的剪切力會(huì)引起細(xì)胞損傷，不利于高密度發(fā)酵[19]。

Nisin 的工業(yè)生產(chǎn)通常采用補(bǔ)料分批發(fā)酵和pH 控制發(fā)酵方式，將發(fā)酵液中乳酸的濃度維持在毒性水平以下[20?21]。但由于高滲透壓和酸性陰離子的存在，這些方法的生產(chǎn)效率較低。雖然雙水相體系和樹脂吸附法能夠從發(fā)酵液中原位回收乳酸，但是有機(jī)試劑會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞造成不可逆損害[22?23]?；谖⑸锶后w感應(yīng)效應(yīng)，在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)特定菌株來改善發(fā)酵環(huán)境的研究受到人們的廣泛關(guān)注[24]。Hamedi 等[25]提出將解脂耶氏酵母（以乳酸為碳源）和乳酸鏈球菌混合發(fā)酵來提高Nisin 產(chǎn)量，但解脂耶氏酵母會(huì)大量分泌有機(jī)酸，發(fā)酵液依然存在酸化問題。為了避免泡沫夾帶菌體細(xì)胞，Cui 等[26]設(shè)計(jì)了一種新型發(fā)酵-泡沫分離耦合裝置，利用0.45 μm的混合纖維膜來阻斷菌體細(xì)胞與氣泡的接觸，但Nisin 的分離效率較低。細(xì)胞固定化是通過化學(xué)或物理方法把游離態(tài)細(xì)胞定位在一個(gè)固定的區(qū)域內(nèi)，并有效保持細(xì)胞活性的技術(shù)[27]。Gao 等[28]以κ-卡拉膠為包埋載體，制備了乳酸鏈球菌固芯凝膠顆粒，并將其負(fù)載于絲瓜絡(luò)的孔道結(jié)構(gòu)中，進(jìn)行發(fā)酵-泡沫分離耦合連續(xù)生產(chǎn)Nisin。由于凝膠顆粒的空間位阻限制了細(xì)胞生長(zhǎng)和物質(zhì)擴(kuò)散，有害代謝產(chǎn)物會(huì)加速菌體細(xì)胞衰老或自溶，Nisin 的單批次產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于游離細(xì)胞發(fā)酵。微膠囊是一種新興的細(xì)胞固定化方法，其內(nèi)部液芯環(huán)境可以為細(xì)胞提供生長(zhǎng)空間，并且囊膜允許雙向擴(kuò)散營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，有助于實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵[29]。微膠囊固定細(xì)胞的關(guān)鍵在于選擇適宜的制備材料，其應(yīng)符合以下條件：（1）成膜材料中至少有一種聚合物；（2）聚合物帶有電荷或通過調(diào)節(jié)pH 而帶有電荷，以便發(fā)生凝聚成膜反應(yīng)；（3）成膜材料應(yīng)具有良好的生物相容性；（4）材料易得，生物穩(wěn)定性好，界面反應(yīng)條件溫和，界面凝聚反應(yīng)迅速[30]。海藻酸鹽、殼聚糖、淀粉和瓊脂等天然多糖是常用的囊材。

基于以上研究，本文擬采用能夠代謝乳酸的釀酒酵母為輔助菌與乳酸鏈球菌進(jìn)行共培養(yǎng)，并對(duì)雙菌進(jìn)行微膠囊固定化，構(gòu)建發(fā)酵與泡沫分離耦合系統(tǒng)強(qiáng)化Nisin 生產(chǎn)。首先，建立乳酸鏈球菌與釀酒酵母共培養(yǎng)發(fā)酵體系，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。隨后，優(yōu)化了海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉（ACA）液芯微膠囊制備條件。最后，以富集比、回收率和Nisin 總效價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究發(fā)酵和泡沫分離耦合時(shí)間，氣泡尺寸及氣體體積流率對(duì)Nisin 回收效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸鏈球菌（Lactococcus lactissubsp.lactisATCC 11454）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeW303-1A）、和藤黃八疊球菌（Micrococcus luteusNCIB 8166） 均由河北工業(yè)大學(xué)生物工程系菌種保藏室提供，并于4 ℃進(jìn)行低溫保存；蛋白胨生物試劑、酵母浸粉生物試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乳糖、蔗糖、葡萄糖 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑廠科技有限公司；殼聚糖、海藻酸鈉、檸檬酸鈉、KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O、Na2HPO4分析純，天津市登峰化學(xué)試劑廠。

752N 紫外可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；BKQ-Z30I 高壓蒸汽滅菌鍋 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；Agilent 1100 高效液相色譜儀美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 釀酒酵母種子培養(yǎng)基：蛋白胨2.0 g/L，酵母浸粉1.0 g/L，葡萄糖2.0 g/L，自然pH。121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min[31]。

乳酸鏈球菌種子培養(yǎng)基：蛋白胨15 g/L，酵母浸粉15 g/L，蔗糖15 g/L，NaH2PO420 g/L，NaCl 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 為6.9。121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min[32]。

共培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨15.0 g/L，酵母浸粉15.0 g/L，KH2PO415.0 g/L，NaCl 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，4.0%碳源；初始pH 為6.9。121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

效價(jià)檢測(cè)SI 培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g/L，胰蛋白胨8.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，酵母浸粉3.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，Tween 20 5.0 mL/L，瓊脂10.0 g/L，pH 為7.2。121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min[32]。

1.2.2 共培養(yǎng)可行性探究實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 共培養(yǎng)發(fā)酵和純培養(yǎng)發(fā)酵 將乳酸鏈球菌種子液和釀酒酵母種子液分別以3%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于150 r/min，30 ℃條件下進(jìn)行共培養(yǎng)發(fā)酵，分別以相同接種量的乳酸鏈球菌和釀酒酵母的純培養(yǎng)（單一菌體）發(fā)酵液作為對(duì)照組；每3 h 取樣一次，并于600 nm 條件下測(cè)定發(fā)酵液吸光值。

1.2.2.2 生物量檢測(cè) 采用分光光度法于600 nm 處測(cè)量樣品的吸光值（OD600），通過繪制出乳酸鏈球菌和釀酒酵母純培養(yǎng)和共培養(yǎng)發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線，來確定菌體生物量。采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定乳酸鏈球菌和釀酒酵母的活細(xì)胞濃度[33]，分別取乳酸鏈球菌和釀酒酵母單一培養(yǎng)種子液，通過磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)梯度均稀釋10 倍，隨后分別添加5 mg/L環(huán)己酰亞胺(抑制釀酒酵母生長(zhǎng))和5 mg/L 鏈霉素（抑制乳酸鏈球菌生長(zhǎng)）的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行均勻涂布，30 ℃培養(yǎng)36 h，分別測(cè)定乳酸鏈球菌種子液和釀酒酵母種子液的活細(xì)胞濃度(CFU/mL)。

1.2.3 共培養(yǎng)發(fā)酵條件的選擇

1.2.3.1 碳源篩選 為了研究碳源對(duì)乳酸鏈球菌與釀酒酵母共培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)Nisin 的影響，將乳酸鏈球菌種子液和釀酒酵母種子液分別按照3%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接入不同碳源（4%葡萄糖、4%乳糖和4%蔗糖）的乳酸鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)，并于30 ℃、150 r/min 下共培養(yǎng)發(fā)酵24 h，分別測(cè)定發(fā)酵液的Nisin 效價(jià)和pH。

1.2.3.2 接種比例的篩選 選定乳酸鏈球菌與釀酒酵 母 的 初 始 接 種 比 例 為10?1:1、100:1、101:1、102:1、103:1、104:1，固定釀酒酵母的接種量為3%，于150 r/min，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后，分別取樣測(cè)定發(fā)酵液的Nisin 效價(jià)。

1.2.3.3 Nisin 效價(jià)測(cè)定 本研究采用改良的雙劑量瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定Nisin 效價(jià)[30]。將含檢測(cè)菌的SI 培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并于4 ℃儲(chǔ)藏30 min，然后用7 mm 的無(wú)菌空心打孔器在凝固的瓊脂上打孔。將Nisin 標(biāo)準(zhǔn)液和樣品注入孔中（每孔135 μL），置于生化培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)24 h，用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件（Auto CAD）測(cè)量抑菌區(qū)直徑，并根據(jù)抑菌區(qū)直徑和Nisin 標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)計(jì)算出樣品溶液的效價(jià)。

1.2.4 ACA 液芯微膠囊細(xì)胞固定化條件選擇

1.2.4.1 固定化工藝 取乳酸鏈球菌種子液和釀酒酵母種子液按照一定接種比例混合，于6000 r/min和4 ℃條件下離心10 min，保留菌泥。隨后，將乳酸鏈球菌與釀酒酵母的菌懸液按照體積比10:1 與海藻酸鈉溶液均勻混合。以5.0 mL/min 速率將該混合溶液滴加到20.0 g/L CaCl2溶液中，固化2 h，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，得到雙菌共固定的海藻酸鈣凝膠珠。將其置于殼聚糖溶液（pH 5.5）中覆蓋殼聚糖膜，制得雙菌共固定的海藻酸鈣-殼聚糖固芯微膠囊。海藻酸鈣與殼聚糖的靜電聚合反應(yīng)如圖1 所示。在0.05%海藻酸鈉溶液在微膠囊表面覆膜一定時(shí)間后，用0.50 g/L 檸檬酸鈉溶液對(duì)固芯微膠囊進(jìn)行液化，制得雙菌共固定化的海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈣液芯微膠囊。

圖1 海藻酸鈣的羧基與殼聚糖的氨基靜電作用示意圖Fig.1 Electrostatic interaction between the carboxyl of sodium alginate and amino of chitosan

1.2.4.2 海藻酸鈉濃度的選擇 為了探究海藻酸鈉濃度對(duì)雙菌共固定微膠囊的影響，分別用9、12、15、18、21 g/L 的海藻酸鈉溶液制備ACA液芯微膠囊，并以Nisin 效價(jià)和發(fā)酵液菌體濃度為指標(biāo)對(duì)微膠囊性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.4.3 殼聚糖濃度的選擇 分別用4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 g/L 的殼聚糖溶液對(duì)海藻酸鈣凝膠珠進(jìn)行覆膜，制備雙菌共固定ACA 液芯微膠囊，并以Nisin 效價(jià)和發(fā)酵液菌體濃度為指標(biāo)對(duì)微膠囊性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.5 微膠囊固定細(xì)胞發(fā)酵耦合泡沫分離生產(chǎn)Nisin條件選擇

1.2.5.1 生產(chǎn)工藝 微膠囊固定細(xì)胞發(fā)酵-泡沫分離耦合裝置如圖2 所示，泡沫分離塔由高度600 mm、內(nèi)徑40 mm 的有機(jī)玻璃管制成，與1.5 L 的發(fā)酵罐銜接在一起。在塔底安裝燒結(jié)玻璃制成的氣體分布器，氣體體積流率通過氣體轉(zhuǎn)子流量計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。首先，將800 mL 滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐。隨后，乳酸鏈球菌和釀酒酵母按一定比例接種到共培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)一段時(shí)間。發(fā)酵-泡沫分離耦合操作開始后，將無(wú)菌空氣泵入泡沫分離塔產(chǎn)生氣泡。泡沫通過塔頂?shù)牡筁 形末端流入收集器中，并采用機(jī)械攪拌進(jìn)行消泡。

圖2 固定化微囊發(fā)酵-泡沫分離耦合裝置Fig.2 Immobilized fermentation-foam fractionation containing microcapsules coupling device

1.2.5.2 耦合時(shí)間的篩選 發(fā)酵溫度為30 ℃、分布器孔徑為180 μm、氣體體積流率為60 mL/min，以富集比、回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在發(fā)酵18～27 h 期間，探究耦合時(shí)間對(duì)Nisin 分離效率的影響。

1.2.5.3 分布器孔徑的篩選 發(fā)酵溫度為30 ℃、耦合時(shí)間為發(fā)酵24 h、氣體體積流率為60 mL/min，以富集比、回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究分布器孔徑（125、150、180、250 和425 μm）對(duì)發(fā)酵液中Nisin 分離效率的影響。

1.2.5.4 氣體體積流率的篩選 發(fā)酵溫度為30 ℃、耦合時(shí)間為發(fā)酵24 h、分布器為180 μm，以富集比、回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究氣體體積流率（20～120 mL/min）對(duì)發(fā)酵液中Nisin 分離效率的影響。

1.2.5.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定 Nisin 的分離效率可通過富集比（E）和回收率（R，%）來評(píng)價(jià)，如式（1）和式（2）所示。

式中，Cf和Ce分別為消泡液和殘余發(fā)酵液中Nisin 的效價(jià)，IU/mL；Vf和Ve分別為消泡液和殘余發(fā)酵液的體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，并通過Origin 和Auto CAD軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鏈球菌與釀酒酵母共培養(yǎng)的可行性研究

如圖3 所示，乳酸鏈球菌與釀酒酵母共培養(yǎng)發(fā)酵液的生物量明顯高于這兩種菌的純培養(yǎng)。純培養(yǎng)發(fā)酵條件下，乳酸鏈球菌生長(zhǎng)迅速，快速進(jìn)入指數(shù)期，但20 h 后生物量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；而釀酒酵母生長(zhǎng)較為緩慢，20 h 后開始進(jìn)入指數(shù)期。發(fā)酵液初始pH 明顯高于釀酒酵母的最適pH4.0[34]，所以在純培養(yǎng)發(fā)酵過程中釀酒酵母生長(zhǎng)緩慢。共培養(yǎng)發(fā)酵條件下，乳酸鏈球菌分泌的有機(jī)酸會(huì)引起發(fā)酵液酸化，從而為釀酒酵母的生長(zhǎng)提供了條件[35]。此外，已有研究表明乳酸菌和酵母菌之間存在營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)作用，乳酸菌會(huì)刺激酵母菌生長(zhǎng)并分泌氨基酸（如纈氨酸、亮氨酸）和維生素B6，進(jìn)一步促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝過程[36]，所以共培養(yǎng)發(fā)酵液的生物量明顯高于乳酸鏈球菌的純培養(yǎng)，且穩(wěn)定期延長(zhǎng)。因此，乳酸鏈球菌與釀酒酵母之間存在互利共生作用，可以進(jìn)行共培養(yǎng)發(fā)酵。

圖3 乳酸鏈球菌和釀酒酵母的共培養(yǎng)和純培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curves of Lactococcu slactiss ubsp.lactis and Saccharomyces cerevisiae in pure cultivation and co-cultivation

2.2 共培養(yǎng)碳源篩選

由圖4 可知，以4%乳糖為碳源時(shí)，Nisin 效價(jià)和發(fā)酵液pH 均為最高，分別為3162.3 IU/mL 和5.27；以4%蔗糖和4%葡萄糖為碳源時(shí)，Nisin 效價(jià)十分接近。釀酒酵母不能代謝乳糖，僅能夠以乳酸鏈球菌代謝的副產(chǎn)物乳酸為碳源[37]，從而解除乳酸鏈球菌發(fā)酵的pH 抑制，促進(jìn)其生長(zhǎng)代謝和Nisin 合成，因此乳糖培養(yǎng)基中Nisin 效價(jià)和pH 最高。然而，釀酒酵母和乳酸鏈球菌均可代謝葡萄糖和蔗糖生成乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵液的pH 迅速降低，從而抑制Nisin 的生物合成。所以，4%葡萄糖發(fā)酵液和4%蔗糖發(fā)酵液的Nisin 效價(jià)和pH 明顯低于4%乳糖發(fā)酵液。因此，為了提高Nisin 產(chǎn)量，本研究選擇4%乳糖作為共培養(yǎng)發(fā)酵的底物碳源。

圖4 碳源類型對(duì)Nisin 效價(jià)和發(fā)酵液pH 的影響Fig.4 Effects of carbon source type on Nisin titer and pH of fermentation broth

2.3 乳酸鏈球菌與釀酒酵母的最佳接種比例

如圖5 所示，隨著乳酸鏈球菌與釀酒酵母接種比例的升高，Nisin 效價(jià)呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，pH 呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。隨著乳酸鏈球菌與釀酒酵母初始接種比例從10?1:1 增加到102:1 時(shí)，乳酸鏈球菌接種的初始細(xì)胞濃度逐漸增加，細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝速度加快，促進(jìn)了Nisin 的快速合成。乳酸鏈球菌與釀酒酵母初始接種比例從102:1 增加到104:1 時(shí)，由于乳酸鏈球菌初始接種的細(xì)胞濃度較高，釀酒酵母不能完全吸收其分泌的有機(jī)酸，培養(yǎng)基酸化降低了乳酸鏈球菌細(xì)胞內(nèi)酶的活性及其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用速率，從而降低了Nisin 的合成速率。因此，本研究中乳酸鏈球菌與釀酒酵母的最佳接種比例為102:1。

圖5 乳酸鏈球菌與釀酒酵母接種比例對(duì)Nisin 效價(jià)的影響Fig.5 Effects of inoculation ratio of L. lactis and S. cerevisiae on Nisin titer

2.4 ACA 液芯微膠囊細(xì)胞固定化條件優(yōu)化

2.4.1 海藻酸鈉濃度的確定 如圖6 所示，海藻酸鈉濃度從9 g/L 增加到15 g/L 時(shí)，Nisin 效價(jià)緩慢降低；而海藻酸鈉濃度從15 g/L 增加到21 g/L 時(shí)，Nisin效價(jià)迅速下降。海藻酸鈉濃度從9 g/L 增加到15 g/L時(shí)，發(fā)酵液中菌體生物量明顯下降；海藻酸鈉濃度從15 g/L 增加到21 g/L 時(shí)，發(fā)酵液中菌體生物量平緩下降。海藻酸鈉濃度從9 g/L 增加到15 g/L 時(shí)，海藻酸鈉的-COO-和Ca2+逐漸結(jié)合充分，微膠囊壁膜的致密性和機(jī)械強(qiáng)度增加，發(fā)酵過程中剪切作用導(dǎo)致囊膜破裂，菌體細(xì)胞泄漏情況減少[38]，因此，發(fā)酵液中的菌體生物量明顯下降，Nisin 效價(jià)緩慢降低。當(dāng)海藻酸鈉濃度高于15 g/L 時(shí)，過高的海藻酸鈉濃度會(huì)引起溶液粘度增加，阻礙Ca2+的移動(dòng)，限制其與-COO-的結(jié)合，造成微膠囊內(nèi)所含活菌數(shù)下降，進(jìn)一步影響Nisin 的合成與傳質(zhì)，因此，發(fā)酵液中的菌體生物量降低，Nisin 效價(jià)變化明顯。綜合考慮微囊固定化效果和Nisin 效價(jià)，選擇15 g/L 的海藻酸鈉濃度制作乳酸鏈球菌與釀酒酵母的固定化微膠囊。

圖6 海藻酸鈉濃度對(duì)Nisin 效價(jià)和生物量的影響Fig.6 Effect of sodium alginate concentration on Nisin titer and biomass

2.4.2 殼聚糖濃度的確定 如圖7 所示，殼聚糖濃度從4.5 g/L 增加到5.5 g/L，Nisin 效價(jià)緩慢下降，發(fā)酵液中菌體生物量迅速下降。這是因?yàn)闅ぞ厶菨舛仍礁?，溶液中活潑氨基的?shù)量越大，與海藻酸鈉分子中的-COO-發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成的半透膜致密程度越高，微膠囊壁膜的穩(wěn)定性和支撐作用越高[10]，對(duì)Nisin 的傳質(zhì)效果影響較小。殼聚糖濃度從5.5 g/L 增加到6.5 g/L，Nisin 效價(jià)下降速度增加，發(fā)酵液中菌體生物量緩慢降低。這是由于過高的殼聚糖濃度會(huì)引起半透膜的滲透性降低，直接影響到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和發(fā)酵產(chǎn)物在囊膜兩側(cè)的傳遞，不利于菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。綜合考慮微膠囊傳質(zhì)性能和Nisin 效價(jià)，選擇5.5 g/L的殼聚糖濃度制作乳酸鏈球菌與釀酒酵母的固定化液芯微膠囊。

圖7 殼聚糖濃度對(duì)Nisin 效價(jià)和生物量的影響Fig.7 Effects of chitosan concentration on Nisin titer and biomass

2.5 發(fā)酵-泡沫分離耦合生產(chǎn)Nisin 的工藝研究

2.5.1 耦合時(shí)間對(duì)Nisin 分離效率的影響 如圖8（A）所示，隨著耦合時(shí)間從18 h 增加到27 h，發(fā)酵液中Nisin 的效價(jià)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在耦合24 h 效價(jià)最高。隨著泡沫分離耦合微膠囊固定細(xì)胞耦合的起始時(shí)間越晚，Nisin 富集比先從4.7 下降到3.2，隨后增加至3.8；而其回收率先從61.2%增加至78.9%，然后下降到65.3 %。這是由于氣體鼓入發(fā)酵罐后，發(fā)酵液中Nisin 效價(jià)越高，Nisin 在氣泡表面的表面過剩越高，增加了氣泡表面液膜厚度和持液能力，從而提高泡沫的持液率和穩(wěn)定性[39]。泡沫夾帶大量間隙液進(jìn)入消泡液，Nisin 的富集比降低，回收率增加。

圖8 發(fā)酵-泡沫分離耦合時(shí)間對(duì)Nisin 的富集比/回收率和總效價(jià)的影響Fig.8 Effects of initial coupling time of fermentation and foam fractionationon enrichment ratio and recovery percentage of Nisin and total titer of Nisin

由圖8（B）所示，在任意耦合時(shí)間條件下，微膠囊固定細(xì)胞發(fā)酵-泡沫分離耦合操作Nisin 總效價(jià)均高于非耦合操作。并且在發(fā)酵21 h 后進(jìn)行泡沫分離耦合操作時(shí)，發(fā)酵液中Nisin 總效價(jià)最高，為3824.7 IU/mL。當(dāng)泡沫分離較早耦合于微膠囊固定細(xì)胞發(fā)酵時(shí)，氣泡會(huì)將大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)帶離培養(yǎng)基，導(dǎo)致菌體細(xì)胞對(duì)底物基質(zhì)的利用率降低，Nisin 的合成速率緩慢[40]。當(dāng)泡沫分離耦合于微膠囊固定細(xì)胞發(fā)酵的起始時(shí)間較晚時(shí)，Nisin 在發(fā)酵液中的積累會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)物抑制，抑制其自身的合成。綜合以上分析，可在微膠囊固定細(xì)胞發(fā)酵21 h 進(jìn)行發(fā)酵-泡沫分離耦合操作回收Nisin。

2.5.2 分布器孔徑對(duì)Nisin 分離效率的影響 如圖9所示，隨著氣體分布器孔徑從125 μm 增大到425 μm，Nisin 富集比由4.3 增大至6.9，其回收率由79.1%下降到48.9%；Nisin 總效價(jià)由3452.1 IU/mL 增加到4113.2 IU/mL。氣體分布器的孔徑越大，液相中氣泡的初始尺寸越大[41]。小尺寸氣泡在液相中上升速度慢，有利于Nisin 分子吸附在氣泡表面，增大氣泡周圍液膜的厚度，所形成的泡沫穩(wěn)定性越強(qiáng)，將大量發(fā)酵液夾帶出發(fā)酵體系，不利于菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。與小氣泡相比，大氣泡界面能更低，氣泡之間聚結(jié)和歧化作用會(huì)降低泡沫穩(wěn)定性，導(dǎo)致發(fā)酵液夾帶能力差，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失少。因此，隨著氣體分布器孔徑的增加，Nisin 的富集比增加，回收率降低，總效價(jià)增加。綜合考慮Nisin 的富集比、回收率以及總效價(jià)，選擇孔徑為180 μm 的氣體分布器進(jìn)行發(fā)酵-泡沫分離耦合操作。

圖9 氣體分布器孔徑對(duì)Nisin 的富集比、回收率和總效價(jià)的影響Fig.9 Effects of pore diameter of gas distributor on enrichment ratio andrecovery percentage of Nisin, and total titer of Nisin

2.5.3 氣體體積流率對(duì)Nisin 分離效率的影響 如圖10 所示，隨著氣體體積流率從20 mL/min 升高到120 mL/min，Nisin 富集比由6.5 下降到3.8，而其回收率由52.1%增加到83.7%。同時(shí)，發(fā)酵液中Nisin 總效價(jià)由4083.1 IU/mL 降至3469.8 IU/mL。隨著氣體體積流率的增加，溶液中氣泡的生成速度加快，氣泡在分離塔內(nèi)的停留時(shí)間縮短，且泡沫的迅速堆積增加了plateau 邊界通道數(shù)量，阻礙了夾帶溶液的回流[42]。泡沫的持液率較高，導(dǎo)致發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大幅度減少。因此，隨著氣體體積流率的增加，Nisin 的回收率增加，富集比下降。此外，氣體體積流率越大，發(fā)酵液的氣含率越高，氣泡運(yùn)動(dòng)對(duì)液芯微膠囊膜造成的剪切破壞越強(qiáng)。綜合考慮Nisin 的富集比、回收率以及總效價(jià)，選擇40 mL/min 作為發(fā)酵-泡沫分離耦合操作的最適氣體體積流率。

圖10 氣體體積流率對(duì)Nisin 的富集比、回收率和總效價(jià)的影響Fig.10 Effects of volumetric air flow rate on enrichment ratio andrecovery percentage of Nisin, and total titer of Nisin

綜上，利用微膠囊固定細(xì)胞發(fā)酵耦合泡沫分離生產(chǎn)Nisin，在耦合時(shí)間為21 h，分布器孔徑180 μm，氣體體積流率40 mL/min 條件下，Nisin 的富集比和回收率分別為5.8 和63.1 %，總效價(jià)為3973.2 IU/mL。

3 結(jié)論

本文開發(fā)了一種乳酸鏈球菌與釀酒酵母雙菌微囊化發(fā)酵與泡沫分離耦合強(qiáng)化Nisin 生產(chǎn)的新工藝，并對(duì)操作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以4%乳糖為底物碳源，乳酸鏈球菌與釀酒酵母的初始接種比例為102:1 時(shí)，共培養(yǎng)發(fā)酵液中Nisin 效價(jià)較乳酸鏈球菌純培養(yǎng)顯著提高。采用ACA 液芯微膠囊包埋乳酸鏈球菌與釀酒酵母，其制備條件為海藻酸鈉濃度15 g/L 和殼聚糖濃度5.5 g/L。利用微膠囊固定細(xì)胞發(fā)酵耦合泡沫分離生產(chǎn)Nisin，在耦合時(shí)間為21 h，分布器孔徑180 μm，氣體體積流率40 mL/min 條件下，Nisin 的富集比和回收率分別為5.8 和63.1 %，總效價(jià)為3973.2 IU/mL。