何建新，胡艷玲，何汶珊，雷詩涵，劉詩泳，羅仕洋，屈廷啟

（湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430068）

桑葉為國家衛(wèi)生部藥食同源[1]名錄的品種。桑葉中含有黃酮、生物堿、揮發(fā)油、甾類、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)等[2?3]活性成分，具有降血壓、降血脂[4]、降血糖[5?6]、抗炎[7]、抗病毒[8]、抗衰老[9?10]、減肥[11]和抗癌[12]等多種療效。目前隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高及價值觀念和生活方式的改變，人們對以桑葉為原料研制的食品和保健品有了進(jìn)一步的認(rèn)識，對這類產(chǎn)品的需求逐步增大，尤其是桑葉茶倍受消費者青睞[13?14]。

目前桑葉茶加工以桑綠茶為主[15]，普遍存在湯色發(fā)黑、豆腥味重、感官品質(zhì)不佳[16]等問題，有的研究涉及了現(xiàn)代微生物發(fā)酵工藝[17]，如陳永麗等[18]采用米曲霉和毛霉研究桑葉茶的水浸出物含量、感官評分和游離氨基酸含量變化，肖洪等[19]采用黑曲霉、日本根霉和綠色木霉研究桑葉中脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）、黃酮、多糖和多酚生物活性成分含量的變化，但都未見有效去除桑葉茶青腥味的方法，實驗制得的桑葉茶飲用口感欠佳。目前國內(nèi)外將大曲用于桑葉茶發(fā)酵的方法尚未見報道。傳統(tǒng)大曲含有豐富的營養(yǎng)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)以及適量的無機(jī)鹽等，能夠供給有益微生物生長所需要的營養(yǎng)成分[20]。且其菌種量大，含量相比小曲、紅曲多，多菌種發(fā)酵提供了多種微生物混合體系，對發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量、風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用[21]。通過發(fā)酵，桑葉中有效的生物活性成分黃酮、多酚含量會有一定程度的增加，蛋白質(zhì)會水解成氨基酸，產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[19,22,23]，提升飲用品質(zhì)及營養(yǎng)價值。

本文采用新鮮桑葉為原料，首次利用濃香型大曲發(fā)酵桑葉茶，通過單因素實驗、響應(yīng)面-主成分分析法確定最佳發(fā)酵工藝條件，改善桑葉茶口感，提升桑葉茶品質(zhì)，保留桑葉茶中黃酮、氨基酸等有效成分，以期為桑葉產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 湖北宜昌地區(qū)，秋季果桑；宜賓產(chǎn)濃香型大曲 武漢天龍黃鶴樓酒有限公司；水塔陳醋 市售；蘆?。?9%）、沒食子酸（99%）、茚三酮（99%）、福林酚顯色劑（BR） 上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、鹽酸、磷酸鹽緩沖液、谷氨酸 分析純，國藥集團(tuán)。

UPT-II-20T 超純水制備設(shè)備 成都超純科技有限公司；DK-S22 型恒溫水浴箱、DUG-9246A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；CP213 型電子天平 國象斯儀器上海有限公司；STARTER3100 型pH 計 OHAUS；1000u 型移液槍 邁德飛；752N 型紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；800Y 型高速多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司；SHB-III 型抽濾機(jī) 上海比朗儀器有限公司；JP-020 型超聲波清洗機(jī) 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；DH3600B-II 型生化培養(yǎng)箱 天津泰斯特。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葉茶發(fā)酵工藝流程 桑葉→分級（根據(jù)葉片大小）→洗滌→鹽漬→洗滌→醋蒸→洗滌→揉捻→發(fā)酵→中溫烘干→高溫烘培

采摘：統(tǒng)一采摘湖北宜昌地區(qū)新鮮桑葉，清洗干凈；

鹽漬：鹽水濃度為2 g/L[21]，倒入浸漬池中，取清洗后同一級別的桑葉放入鹽水中，并輕輕翻動，使桑葉和鹽水充分接觸，在鹽水溫度為30 ℃時下鹽漬22 min；

醋蒸：將水塔陳醋用水調(diào)制成60 mL/L 食用醋水倒入蒸鍋底部，加蓋，加熱至醋水沸騰，揭蓋，取鹽漬后的桑葉經(jīng)洗滌后置于隔篦上，鋪勻，加蓋繼續(xù)加熱，15 min 后揭蓋，轉(zhuǎn)入下道工序；

揉捻：待桑葉微風(fēng)萎凋，瀝干水分后，將桑葉切割成長寬各2～3 cm 的葉片，置于揉捻機(jī)中揉捻成球狀體，轉(zhuǎn)入下道工序；

發(fā)酵：參考雷詩涵等[21]的方法，并稍作修改，稱量上道工序預(yù)處理過的桑葉，置于帶蓋的發(fā)酵缸中至滿缸。按照每組實驗的初始糖度、大曲接種量、葉子含水量稱取所需桑葉重量的特制大曲、蔗糖，置于滅菌的三角瓶中，用適量水溶解并攪拌，待液面有氣泡出現(xiàn)，均勻淋撒于發(fā)酵缸中桑葉表面，輕輕按壓，蓋上缸蓋，置于對應(yīng)溫度下發(fā)酵24 h，而后調(diào)至55 ℃，發(fā)酵24 h，結(jié)束發(fā)酵。

干燥：將發(fā)酵后桑葉均勻鋪撒在烘箱的隔篦上，80 ℃烘干。烘焙期間，每隔20～25 min 將桑葉翻動一遍，待桑葉表面干燥，揉搓可碎裂時，即烘干完成；調(diào)整烘箱溫度在120 ℃，持續(xù)通風(fēng)加熱，待烘箱通風(fēng)口散發(fā)出清香，烘焙基本完成，然后將桑葉置于相對濕度55%～65%的潔凈環(huán)境中使其回潮、冷卻，待桑葉溫度降至室溫時，即制得桑葉茶。

1.2.2 單因素實驗 固定初始條件為：發(fā)酵溫度35 ℃，初始糖度8%，大曲接種量8%，葉子含水量70%，在其他條件固定的情況下，考察發(fā)酵溫度（15、20、25、30、35 ℃）、初始糖度為（4%、6%、8%、10%、12%）、大曲接種量（4%、6%、8%、10%、12%）、葉子含水量（60%、65%、70%、75%、80%）對桑葉茶中總酚、氨基酸、黃酮含量以及感官評價的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗 據(jù)單因素實驗結(jié)果，以桑葉茶發(fā)酵的發(fā)酵溫度（A）、初始糖度（B）、大曲接種量（C）、葉子含水量（D）為自變量，規(guī)范化綜合得分為響應(yīng)值，根據(jù)Box－Behnken 中心組合原理設(shè)計四因素三水平的試驗，確定最佳工藝，實驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface methodology

1.2.4 氨基酸測定 按照GB/T 8314-2013 茶游離氨基酸總量的檢測方法[24]進(jìn)行測定。

1.2.5 黃酮測定 精密稱取桑葉粉5 g，置錐形瓶中，加入85%乙醇100 mL，超聲輔助萃取兩次，于35 kHz 下每次30 min，過濾，并用少量的乙醇洗滌濾渣，定容到250 mL，搖勻，即得到總黃酮的樣品液。吸取1.0 mL 樣品液稀釋5 倍，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法[25]測定，加入0.5 mol/L 的NaNO2溶液0.5 mL 搖勻，5 min 后加入0.3 mol/L 的Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻，加入1.0 mol/L 的NaOH 溶液2.5 mL，用80%乙醇定容至8 mL，在波長510 nm 處測OD 值。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，盧丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（C）為橫坐標(biāo)，得到線性方程為A=1.3291C?0.0153，R2達(dá)到0.9995，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算，計算出樣品中的黃酮含量。

1.2.6 總酚測定 精密稱取桑葉粉1 g，加沸水80 mL，沸水浴浸提30 min，趁熱過濾，定容至100 mL，即得到總酚樣品液。吸取1 mL 樣品液，按照福林酚法[25]測定，將樣品液置于25 mL 的棕色容量瓶中，加蒸餾水至6.0 mL，然后加入福林酚顯色劑0.5 mL，混勻，在0.5～8 min 內(nèi)加入1.5 mL 20%的Na2CO3溶液，充分混合后定容，30 ℃避光放置0.5 h，760 nm下測定吸光值。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（C）為橫坐標(biāo)，得到線性方程為A=3.7327C+0.0149，R2達(dá)到0.9992，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算，計算出樣品中的總酚含量。

1.2.7 感官評價 按照國標(biāo)GB/T 23776-2018 茶葉感官審評方法[26]進(jìn)行評價。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對桑葉發(fā)酵茶的各指標(biāo)進(jìn)行了主成分分析，得到原始數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)率、累計貢獻(xiàn)率及特征值，將大于1 的特征值因子作為主成分提取標(biāo)準(zhǔn)。按式（1）計算桑葉發(fā)酵茶各個樣品的綜合得分F，再按公式（2）將得到的綜合得分F 進(jìn)行規(guī)范化處理得到規(guī)范化綜合得分Z。

式中:F 為綜合得分，Y1、Y2、Y3為主成分的特征值，F(xiàn)1、F2、F3為桑葉發(fā)酵茶的主成分1、2、3 的得分，C 為累積特征值，Z 為規(guī)范化綜合得分，F(xiàn)max為綜合得分中最大值，F(xiàn)min為綜合得分中最小值。響應(yīng)面試驗設(shè)計以及結(jié)果分析用Design－Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行處理，主成分進(jìn)行因子分析采用SPSS 25.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對桑葉發(fā)酵的影響 由圖1 可知，當(dāng)發(fā)酵時間一定時，隨著溫度的升高，茶葉中氨基酸含量升高。發(fā)酵溫度極大地影響著菌種的代謝產(chǎn)物以及發(fā)酵速率，溫度升高，菌種代謝速率變快，微生物利用桑葉中的蛋白質(zhì)生成氨基酸的速率變快[18]。溫度變化對總酚含量無明顯影響。黃酮含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在30 ℃時，黃酮含量最高，這與孫國霞等[27]的研究結(jié)果相近。桑葉茶感官評價先升后降，25 ℃時口感最佳。因此，綜合溫度對桑葉茶中總酚、氨基酸、黃酮以及感官評價的影響，選擇30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵桑葉茶品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented mulberry leaf tea

2.1.2 初始糖度對桑葉發(fā)酵的影響 由圖2 可知，初始糖度決定發(fā)酵度，隨著初始糖度的增加，總酚，黃酮在桑葉中的含量逐漸降低。氨基酸含量在初始糖度為4%～8%時變化不明顯，在8%～10%時逐漸降低，感官評價先升后降。初始糖度過高，滲透壓過大，抑制微生物的生長，使發(fā)酵不徹底[28]，初始糖度過低，菌種繁殖缺乏碳源及能源，導(dǎo)致發(fā)酵不足，最終影響代謝產(chǎn)物種類、含量和桑葉茶的風(fēng)味。因此確定初始糖度最佳為6%，在此條件下桑葉茶的氨基酸、黃酮、總酚含量相對較高，感官品質(zhì)較好。

圖2 初始糖度對發(fā)酵桑葉茶品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on the quality of fermented mulberry leaf tea

2.1.3 大曲接種量對桑葉發(fā)酵的影響 由圖3 可知，隨大曲接種量的增大對總酚含量無明顯影響，黃酮的含量逐漸下降，這與肖洪等[29]的研究結(jié)果相近。氨基酸含量和感官評價先升后降。隨大曲接種量增大，發(fā)酵速率變快，代謝加強(qiáng)，菌種之間競爭激烈，發(fā)酵體系變化，菌種代謝速率的快慢改變，影響代謝產(chǎn)物種類、含量和桑葉茶的風(fēng)味[30]。因此確定最佳接種量為8%，在此接種量下桑葉茶澄清，茶香純正濃郁，桑葉茶感官品質(zhì)良好，茶中黃酮和氨基酸含量也相對較高。

圖3 大曲接種量對發(fā)酵桑葉茶品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of Daqu inoculation amount on the quality of fermented mulberry leaf tea

2.1.4 葉子含水量對桑葉發(fā)酵的影響 由圖4 可知，隨著葉子含水量的增加，桑葉中黃酮含量相對下降，氨基酸在葉子含水量60%～70%時變化并不明顯，在70%～80%時呈現(xiàn)下降趨勢，總酚含量和感官評價先升后降?？赡苡捎诤窟^高，發(fā)酵物粘度過大，導(dǎo)致氧氣供應(yīng)受阻，菌體的生長以及酶的合成受到影響[18]，含水量過低導(dǎo)致發(fā)酵物過干，微生物難以生長，影響產(chǎn)物的合成[31]，最終影響代謝產(chǎn)物的種類、含量和桑葉茶的風(fēng)味。含水量為65%時，總酚、氨基酸、黃酮含量以及感官品質(zhì)相對較高，故確定最佳葉子含水量為65%。

圖4 葉子含水量對發(fā)酵桑葉茶品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of leaf moisture content on the quality of fermented mulberry leaf tea

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)表1 進(jìn)行Box－ Benhnken 中心組合實驗設(shè)計，共29 個試驗點，研究各因素對桑葉發(fā)酵茶氨基酸，總酚、黃酮、感官評價的影響。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.2.1 桑葉發(fā)酵茶的主成分分析 桑葉發(fā)酵茶的主成分分析采用SPSS 25.0 對表2 中桑葉發(fā)酵茶指標(biāo)氨基酸，總酚、黃酮、感官評價進(jìn)行主成分分析，主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率見表3，根據(jù)大于80%的累積貢獻(xiàn)率原則[30]，提取的三個主成分累積貢獻(xiàn)率為87.692%，可以說明提取的三個主成分能夠全面地反映桑葉發(fā)酵茶的品質(zhì)信息。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

表3 桑葉發(fā)酵茶主成分的貢獻(xiàn)率及特征值Table 3 Contribution rate and characteristic value of principal components of mulberry leaf fermented tea

由表4 知，根據(jù)指標(biāo)的特征向量絕對值大小可以看出，決定第一主成分的指標(biāo)主要是感官評價、氨基酸，第二主成分的指標(biāo)主要是總酚、黃酮，第三主成分的指標(biāo)主要是總酚、黃酮。

表4 桑葉發(fā)酵茶的指標(biāo)特征向量值Table 4 Index characteristic vectorial values of fermented mulberry leaf tea

由于各個指標(biāo)間存在單位和變異程度的差異，因此對綜合得分F 進(jìn)行規(guī)范化處理后得到規(guī)范化綜合得分Z，再以Z 作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，其結(jié)果如表5 所示。

表5 主成分得分及規(guī)范化綜合得分Table 5 Principal component score and standardized comprehensive score

2.2.2 規(guī)范化綜合得分的響應(yīng)面分析 利用Design－Expert 8.0.6 軟件對29 個實驗點和對應(yīng)的規(guī)范化綜合得分進(jìn)行多元歸擬合，得到回歸模型方差分析見表6，各因素間的相互作用見圖5，得到的回歸模型方程如下:

圖5 各因素間的交互作用Fig.5 Interaction between factors

Z=0.97?0.086A+0.023B+0.036C+0.25D+0.011 AB?0.052AC+0.062AD?0.00415BC?0.018BD?0.12 CD?0.16A2?0.094B2?0.17C2?0.44D2。由表6 回歸模型方差分析可知，P<0.0001，該模型項顯著性極高，并且該模型失擬項P>0.05，差異性不顯著，表示建模成功，決定系數(shù)R2=0.9550，用此模型可以很好地描述和分析實驗結(jié)果。各因素中，一次項A、D 差異極顯著（P＜0.01），B、C 不顯著，交互項CD 差異顯著（P<0.05），AC、BD、AB、AD、BC 不顯著（P>0.05），二次項A2、C2、D2差異極顯著（P<0.01），B2差異顯著（P<0.05）。按照比較F值大小可知影響桑葉茶發(fā)酵品質(zhì)的因素順序為：葉子含水量（D）>發(fā)酵溫度（A）>大曲接種量（C）>初始糖度（B）。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of regression model

2.2.3 各因素交互分析 由圖2 可以看出，葉子含水量與大曲接種量的響應(yīng)面坡度最陡峭，其等高線形成半橢圓，表明CD 的交互作用顯著（P<0.05），表明對響應(yīng)值規(guī)范化綜合得分影響較大。

2.2.4 驗證實驗 根據(jù)響應(yīng)面分析軟件得出的最佳工藝條件參數(shù)為:發(fā)酵溫度28.85 ℃，初始糖度6.16%，大曲接種量8.1%，葉子含水量66.3%，在此條件下，規(guī)范化綜合得分為1.0105±0.01。通過對預(yù)測工藝優(yōu)化確定條件進(jìn)行調(diào)整發(fā)酵溫度為30 ℃，初始糖度為6%，大曲接種量為8%，葉子含水量為65%發(fā)酵桑葉茶，最終得到桑葉發(fā)酵茶黃酮含量為35.81 mg/g，氨基酸含量為1.38 mg/g，總酚含量為16.68 mg/g，規(guī)范化綜合得分為0.996±0.02，與預(yù)測的數(shù)值基本一致，因此該模型基本準(zhǔn)確，表明響應(yīng)面分析與主成分分析法相結(jié)合得到的桑葉茶發(fā)酵工藝參數(shù)具有一定的可靠性，有實用價值。

3 結(jié)論

以桑葉為原料，濃香型大曲為菌種發(fā)酵桑葉，經(jīng)優(yōu)化實驗確定最佳發(fā)酵工藝條件:發(fā)酵溫度30 ℃，初始糖度6%，大曲接種量8%，葉子含水量65%，制得桑葉茶黃酮含量為35.81 mg/g，氨基酸含量為1.38 mg/g，總酚含量為16.68 mg/g。通過實驗發(fā)現(xiàn)，大曲發(fā)酵桑葉茶是可行的，可以有效增加桑葉茶的風(fēng)味物質(zhì)，改善桑葉茶的口感，通過優(yōu)化工藝參數(shù)，可以有效保留桑葉中的活性成分，對桑葉茶的開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義。