尹明華，胡嘉琦，胡明艷，胡蓉，胡燕榮，黃舒綺，江夢芝，姜夢真，陳榮華，蔡紅

（1.上饒師范學院生命科學學院，江西 上饒 334001；2.上饒市藥食同源植物資源保護與利用重點實驗室，江西 上饒 334001；3.上饒市三葉青保育與利用技術(shù)創(chuàng)新中心，江西 上饒 334001；4.上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001；5.上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西 上饒 334700）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）為葡萄科崖爬藤屬植物，是我國特有的珍稀藥用植物，又名三葉崖爬藤、金線吊葫蘆、蛇附子、石老鼠［1］。三葉青在民間素有藥食兩用習俗，全草均可入藥，以地下塊根和果實的藥用效果最好，近年來臨床多應用于抗癌、抗艾滋病毒、治療血液病、肝炎及肺炎等感染性疾?。?］。藥理研究表明，三葉青具有抗腫瘤、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、保肝以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，無毒無副作用，是目前公認的“植物抗生素”［3］。三葉青一般采用大棚和林下基質(zhì)扦插無性繁殖，極易感染和積累煙草花葉病毒［4］。煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是對農(nóng)作物危害最嚴重的病毒，在世界各地均有分布，能侵染茄科、葫蘆科、十字花科等重要作物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失［5］。煙草花葉病毒在宿主體內(nèi)的復制和運輸需要依靠一些宿主因子才能完成［6］。近年來在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中一些宿主因子基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并證實支持煙草花葉病毒的復制和運輸，如煙草病毒增殖蛋白1（tobamovirus multiplication 1，TOM1）、煙草病毒增殖蛋白2（tobamovirus multiplication 2，TOM2）和煙草病毒增殖蛋白3（tobamovirus multiplication 3，TOM3）［7］。煙草病毒增殖蛋白2有TOM2A和TOM2B之分，TOM2B又有TOM2B isoform X1、TOM2B isoform X2和TOM2B isoform X3等亞型［8］。因此，克隆三葉青TOM2B isoform X1基因并對其進行功能分析，對研究TOM2B isoform X1基因在三葉青中的表達和三葉青煙草花葉病毒的增殖具有重要意義。目前關(guān)于TOM2B isoform X1研究的報道較少。本研究利用RT－PCR技術(shù)克隆懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因，并采用生物信息學、煙草轉(zhuǎn)基因技術(shù)和實時定量PCR對其進行序列、功能和組織表達分析，為揭示懷玉山三葉青TOM2B isoform X1的生物學功能提供理論依據(jù)，并為從分子水平調(diào)控懷玉山三葉青煙草花葉病毒增殖提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

懷玉山三葉青兩個栽培種‘懷玉1號’和‘懷玉2號’試管苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol試劑提取懷玉山三葉青‘懷玉2號’試管苗的總RNA，提取步驟按說明書進行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版，按照M－MLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用Oligo（dT）18 Primer：5′－GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTT TTTTTTTTTTTT－3′，具體步驟按說明書進行。

1.2.2TOM2B isoform X1（TP2BX1）基因的克隆 利用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息（TRINITY_DN12393_c0_g1），運用Primer Premier 5.0設計引物1（F：5′－ATGGCGTCAGCTTCACATTC－3′；R：5′－GCTTGGCGCTGAGGGTTG－3′）。PCR反應體系（總體積50μL）包括17μL ddH2O、25μL 2×Phanta Max Buffer、1μL dNTP Mix（10 mmol／L each）、2μL模板DNA、2μL引物1F（10μmol／L）、2 μL引物1R（10μmol／L）、1μL Phanta Max Super－Fidelity DNA Polymease（1 U／μL）。PCR擴增條件：95℃30 s；95℃15 s，退火45～55℃15 s，延伸72℃1 min，39個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與pMD19－T載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E．coliDH5α，經(jīng)鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.3TOM2B isoform X1基因的生物信息學分析 使用BioEdit軟件翻譯基因序列為氨基酸序列，用ProtParam預測酶的理化性質(zhì)，用ProtScale預測酶的疏／親水性。使用GOR I軟件在線預測酶的二級結(jié)構(gòu)。使用SWISS－MOLD在線預測酶的三級結(jié)構(gòu)。采用WoLFPsort在線預測基因的亞細胞定位。通過軟件DNAMAN和Bioedit進行氨基酸序列比對，利用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.2.4 載體構(gòu)建 用BamHⅠ／KpnⅠ酶切載體pCambia2301－KY－GFP線性化，酶切反應體系包括2μL 10×K／10×L Buffer、5μL載體質(zhì)粒、2 μLBamHⅠ／KpnⅠ和ddH2O（至40μL）。酶切產(chǎn)物純化后與基因（去掉終止密碼子TAG）的PCR產(chǎn)物進行重組反應（重組反應試劑盒為Vazyme公司ClonExpress-ⅡOne Step Cloning Kit）。重組連接反應體系（總體積10μL）包括4μL線性化載體、1μL插入片段、2μL 5×CEⅡBuffer、1μL ExnaseⅡ和ddH2O（補足10μL）。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細胞。挑取PCR陽性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒送測序。PCR檢測和測序引物為插入目的基因兩側(cè)的載體序列，分別為35S－F：5′－GACGCACAATCCCACTATCC－3′；GFP－JR：5′－GGGTGAGCTTGCCGTAGGTG－3′。

1.2.5 煙草葉片亞細胞定位 將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，涂布卡那霉素抗性平板，挑取單克隆于YEB液體培養(yǎng)基在28℃搖床內(nèi)小搖、大搖培養(yǎng)2 d，菌體4 000 r／min離心4 min，去上清后菌體用10 mmol／L MgCl2（含120μmol／L AS）懸浮液重懸，調(diào)整OD600至0.6左右；用無針頭的1 mL注射器吸取農(nóng)桿菌液，從煙草葉片下表皮（背面）壓迫注射；將注射完成的煙草植株弱光培養(yǎng)2 d，即可觀察；接種2 d后取注射區(qū)域的煙草葉片，制作玻片，在激光共聚焦顯微鏡（FLUOVIEW FV1Oi，OLYMPUS公司）下觀察、拍照；同時以空載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌作為對照重復上述操作。葉綠體熒光信號說明：葉綠體熒光信號激發(fā)波長為640 nm，發(fā)射波長為675 nm；GFP信號說明：綠色熒光蛋白GFP激發(fā)光488 nm，發(fā)射光510 nm。

1.2.6TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測

煙草葉片用農(nóng)桿菌侵染后均經(jīng)過4次篩選／繼代，誘導出抗性芽，再轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基中。采用PCR方法對再生苗進行鑒定，得到轉(zhuǎn)TOM2B isoform X1基因的煙草株系。PCR擴增體系（共20 μL）包括7μL ddH2O、10μL 2×TaqMaster Mix、1 μL模板DNA、1μL引物1F（10μmol／L）、1μL引物1R（10μmol／L）。PCR反應程序：預變性95℃5 min；變性95℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃60 s，35個循環(huán)；最終72℃延伸5 min。

1.2.7TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗的病毒接種和光合指標檢測 培養(yǎng)3個月后，取含煙草花葉病毒的三葉青試管苗葉片放在研缽中，加入適量磷酸緩沖液研磨成糊狀病樣汁液；然后在TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性株系和陰性株系移栽苗幼嫩的葉面上撒少許等量金剛砂，蘸取含煙草花葉病毒的煙草試管苗等量病樣汁液在撒了金剛砂的葉面上輕抹3次（模擬蚜蟲的病毒田間傳播），之后用無菌水清洗葉面；然后放入智能人工氣候室內(nèi)澆灌MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)；2個月后采用林國衛(wèi)等［4］的方法對三葉青煙草花葉病毒在TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性株系和陰性株系的表達量進行qRT－PCR檢測，同時采用Li－6400便攜式光合測定儀（LI－COR公司，美國）測定TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性株系和陰性株系移栽苗的光合參數(shù)和葉綠素熒光參數(shù)。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，并使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，應用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗差異顯著性（P＜0.05）。

1.2.8TOM2B isoform X1基因的組織表達分析

分別取懷玉山三葉青兩個栽培種‘懷玉1號’和‘懷玉2號’試管苗的根、莖、葉RNA 500 ng，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR（qRT－PCR，SYBR Green I）檢測內(nèi)參基因為GAPDH，其擴增引物為：F：5′－ACACTTGGCATCTGCTCC－3′；R：5′－TCCGTTCAATCCACCTCC－3′。qRT－PCR檢測采用20μL反應體系，PCR反應程序：預變性95℃10 min；變性95℃10 s，退火延伸51℃34 s，95℃15 s，40個循環(huán)。使用2－△△Ct法計算基因表達水平，重復3次。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，并使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，應用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗TOM2B isoform X1基因組織表達的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因克隆

通過PCR擴增及測序（圖1），懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因cDNA總長度為432 bp（圖2），G＋C含量為50.46%（圖3）。

圖1 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因擴增

圖2 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因序列

圖3 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因各堿基的比例

2.2 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1氨基酸序列特征

ProtParam預測（圖4）顯示懷玉山三葉青TOM2B isoform X1由143個氨基酸組成，分子量15 392.36 Da，等電點7.87，為親水性蛋白。各氨基酸的數(shù)目和比例為Ala（A）14和9.8%，Arg（R）7和4.9%，Asn（N）7和4.9%，Asp（D）3和2.1%，Cys（C）2和1.4%，Gln（Q）11和7.7%，Glu（E）10和7.0%，Gly（G）4和2.8%，His（H）5和3.5%，Ile（I）4和2.8%，Leu（L）16和11.2%，Lys（K）7和4.9%，Met（M）5和3.5%，Pro（P）10和7.0%，Ser（S）21和14.7%，Thr（T）10和7.0%，Val（V）7和4.9%。帶負電殘基（Asp＋Glu）總數(shù)為13，正電荷殘基（Arg＋Lys）總數(shù)為14。序列的N端為M（Met），C端為S（Ser）。失穩(wěn)指數(shù)（II）為63.56，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

圖4 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1氨基酸序列

對蛋白親疏水性進行分析（圖5），高峰值（正值）的區(qū)域表示疏水區(qū)域，而負值的“低谷”區(qū)域是親水區(qū)域。結(jié)果表明，最大疏水值為1.2左右，親水峰最大值為－3.2左右，平均親水系數(shù)為－0.537，說明該蛋白為親水性蛋白。

圖5 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1親疏水值分布

2.3 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1二級結(jié)構(gòu)分析

懷玉山三葉青TOM2B isoform X1的二級結(jié)構(gòu)預測顯示其由α螺旋（Hh，50.35%）、β－片層（Ee，2.10%）、無規(guī)則卷曲（Cc，47.55%）構(gòu)成（圖6、圖7）。從分布位點上來看，C端和N端含無規(guī)則卷曲、β－片層和α－螺旋。

圖6 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1二級結(jié)構(gòu)

圖7 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1二級結(jié)構(gòu)各部分的比例

SWISS－MODEL預測顯示懷玉山三葉青TOM2B isoform X1的三級結(jié)構(gòu)為單體（圖8）。

圖8 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1三級結(jié)構(gòu)

2.4 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1亞細胞定位預測

采用WoLFPsort在線軟件對懷玉山三葉青TOM2B isoform X1的亞細胞定位進行預測，結(jié)果（圖9）顯示，其定位于細胞核中的分布指數(shù)為6，細胞核_質(zhì)膜中的分布指數(shù)為4.5，葉綠體中的分布指數(shù)為3，細胞質(zhì)中的分布指數(shù)為2，線粒體中的分布指數(shù)為2。表明懷玉山三葉青TOM2B isoform X1主要存在于細胞核。

圖9 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1亞細胞定位預測

2.5 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1系統(tǒng)進化分析

通過BLASTP比對，取同源性最高的前15個蛋白進行序列比對及系統(tǒng)進化分析。懷玉山三葉青TOM2B isoform X1同源蛋白的序列比對信息見圖10。從構(gòu)建的進化樹（圖11）可見，懷玉山三葉青與Populus trichocarpa（毛果楊）、Populus euphratica（胡楊）、Populus alba（銀白楊）、Manihot esculenta（南瓜）、Hevea brasiliensis（三葉橡膠）、Prosopis alba（角豆樹）、Citrus clementina（克萊門柚）、Citrussinensis（橙子）和Vitis vinifera（葡萄）在一個大分支下，這說明懷玉山三葉青TOM2B isoform X1在進化上與這些蛋白的親緣關(guān)系較近，尤其是與Vitis vinifera（葡萄）TOM2B isoform X1（GenBank：XP_010664025.1）在進化上具有最高的親緣關(guān)系。

圖10 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1氨基酸序列的同源性比較

圖11 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1系統(tǒng)進化分析

2.6 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因目的片段擴增與瞬時表達載體構(gòu)建

以提供的目的基因序列設計引物（去掉終止密碼子TAG）進行PCR擴增，結(jié)果顯示，在目標位置擴增到單一條帶，大小正確（圖12）。用BamHⅠ／KpnⅠ酶切載體pCambia2301－KY－GFP線性化，回收后和目的基因片段進行重組反應。重組質(zhì)粒測序比對結(jié)果顯示，目的基因已插入載體，表達載體構(gòu)建準確（圖13）。

圖12 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1 基因載體構(gòu)建PCR檢測

圖13 載體pCambia2301－TP2BX1－GFP克隆測序結(jié)果比對

2.7 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1亞細胞定位分析

通過煙草葉片瞬時表達，TOM2B isoform X1定位于細胞質(zhì)和細胞核（圖14），與WoLFPsort在線軟件預測結(jié)果基本一致。

圖14 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1亞細胞定位分析

2.8 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因煙草鑒定和光合特征分析

經(jīng)PCR檢測（圖15），獲得懷玉山三葉青TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性煙株。三葉青TMV的qRT－PCR結(jié)果（圖16）表明，煙草花葉病毒侵染后，懷玉山三葉青TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性植株根、莖、葉的TMV表達量顯著高于轉(zhuǎn)基因陰性煙株。光合生理的測定結(jié)果（表1）表明，與轉(zhuǎn)基因陰性煙株相比，懷玉山三葉青TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、最大光化學效率（Fv／Fm）、實際光化學量子效率（ΦPSⅡ）、光化學淬滅系數(shù)（qP）及電子傳遞效率（ETR）顯著下降，而非光化學淬滅系數(shù)（NPQ）顯著上升。

圖15 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1 轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測

圖16 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性植株與陰性植株的TMV基因相對表達量

表1 懷玉山三葉青TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性植株與陰性植株光合參數(shù)和葉綠素熒光參數(shù)比較

2.9 懷玉山三葉青兩個栽培種不同器官中TOM2B isoform X1基因的表達分析

實時熒光定量PCR分析結(jié)果（圖17）顯示，TOM2B isoform X1基因在懷玉山三葉青兩個栽培種的根、莖、葉中均有表達，但在不同器官中表達量差異顯著，均在葉中表達量最高。

圖17 懷玉山三葉青兩個栽培種不同器官中TOM2B isoform X1基因相對表達量

3 討論與結(jié)論

煙草花葉病毒侵染宿主后，需要依靠宿主內(nèi)一些病毒增殖蛋白（如TOM1、TOM2和TOM3）才能完成其自身的復制［9］。研究表明，TOM1、TOM2A、TOM2B以及TOM2B isoform X1、TOM2B isoform X2和TOM2B isoform X3同源性較高［10］。本研究結(jié)果也表明，懷玉山三葉青TOM2B isoform X1在進化上與Populus trichocarpa（毛果楊）、Populus euphratica（胡楊）、Populus alba（銀白楊）、Manihot esculenta（南瓜）、Hevea brasiliensis（三葉橡膠）、Prosopis alba（角豆樹）、Citrus clementina（克萊門柚）、Citrus sinensis（橙子）和Vitis vinifera（葡萄）在一個大分支下，這說明懷玉山三葉青TOM2B isoform X1在進化上與他們的親緣關(guān)系較近，尤其是與Vitis vinifera（葡萄）TOM2B isoform X1（GenBank：XP_010664025.1）在進化上具有最高的親緣關(guān)系。說明三葉青TOM2B isoform X1基因具有保守性，這些保守區(qū)段的發(fā)現(xiàn)將為其他物種新的三葉青TOM2B isoform X1基因的克隆提供序列依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因cDNA總長度為432 bp，G＋C含量為50.46%，編碼143個氨基酸，分子量15 392.36 Da，等電點7.87，為親水性蛋白。從堿基組成和G＋C含量基本平衡來看，G＋C的含量越高，基因穩(wěn)定性越高，三葉青TOM2B isoform X1基因基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，這可能為三葉青TOM2B isoform X1基因穩(wěn)定遺傳與進化提供了保證。

研究表明，擬南芥TOM1、TOM2和TOM3基因均編碼跨膜蛋白，主要與TMV復制蛋白中的螺旋酶相互作用，幫助復制酶復合體錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或液泡膜等高密度生物膜上［11］。本試驗通過軟件預測懷玉山三葉青TOM2B isoform X1主要存在細胞核中；而通過煙草葉片亞細胞定位分析表明，TOM2B isoform X1定位于細胞質(zhì)和細胞核中，與前人的研究結(jié)果一致。

與液泡膜相關(guān)的宿主蛋白TOM1、TOM2和TOM3是煙草病毒高效增殖所必需的［12］。本試驗結(jié)果表明，在懷玉山三葉青煙草花葉病毒侵染后，懷玉山三葉青TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性煙株根、莖、葉的TMV表達量顯著高于轉(zhuǎn)基因陰性煙株。表明懷玉山三葉青TOM2B isoform X1可以促進懷玉山三葉青煙草花葉病毒的增殖。

馬鈴薯TOM基因在馬鈴薯營養(yǎng)器官和生殖器官具有組織特異性［9］。本試驗結(jié)果也表明，懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因在根、莖、葉中均有表達，但在不同組織器官的表達情況差異顯著，‘懷玉2號’和‘懷玉1號’均在葉中表達量最高。表明懷玉山三葉青TOM2B isoform X1基因主要的表達位置在葉片。

植物感染病毒后會導致種性退化、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣，其根本原因是病毒的侵染造成植物光合效率顯著下降［13］。本試驗結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)基因陰性煙草相比，懷玉山三葉青TOM2B isoform X1轉(zhuǎn)基因陽性煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、最大光化學效率（Fv／Fm）、實際光化學量子效率（ΦPSⅡ）、光化學淬滅系數(shù)（qP）及電子傳遞效率（ETR）顯著下降，而非光化學淬滅系數(shù)（NPQ）顯著上升，表明懷玉山三葉青TOM2B isoform X1通過懷玉山三葉青煙草花葉病毒增殖繼而影響植株的光合作用，這是植物產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣的根本原因。

本研究首次從懷玉山三葉青基因組中克隆出TOM2B isoform X1基因，并對克隆的基因序列和其氨基酸序列進行了生物信息學分析、亞細胞定位以及功能和組織表達分析，為三葉青煙草花葉病毒增殖的研究補充了基礎資料。