曹燕燕，張宏套，郭春強(qiáng)，葛昌斌，廖平安，黃杰，喬冀良，齊雙麗，李雷雷

（漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 漯河 462300）

小麥作為我國的第二大糧食作物，生育期間常遇到干旱、低溫冷害、晚霜凍、干熱風(fēng)等農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害，已成為小麥產(chǎn)量提高的限制因素［1］。近年來，溫室效應(yīng)引起的全球氣候變暖，造成我國冬暖春寒現(xiàn)象頻繁發(fā)生，從而導(dǎo)致小麥春季凍害不斷發(fā)生。拔節(jié)期是春季小麥快速生長期，對水肥要求較高，是決定小麥產(chǎn)量的一個(gè)重要階段［2］，對溫度變化也十分敏感，若此時(shí)突遭大幅度降溫，將嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量，一般減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)減幅達(dá)到50%［3］。黃淮海小麥優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)是我國最大的冬小麥產(chǎn)區(qū)，對確保我國糧食安全具有重大意義［4］。幾乎每年3—4月黃淮麥區(qū)都會(huì)出現(xiàn)2～5 d的大幅度降溫天氣，降溫達(dá)6～10℃，有時(shí)甚至低于0℃，嚴(yán)重影響并制約小麥的生長發(fā)育及產(chǎn)量提高［5，6］。因此，關(guān)于小麥凍害，特別是春季凍害的研究對黃淮麥區(qū)小麥的增產(chǎn)豐收有著十分重要的意義。

春季突遇低溫脅迫時(shí)，小麥植株體內(nèi)會(huì)發(fā)生復(fù)雜的生理生化及分子生物學(xué)變化，表現(xiàn)在膜流動(dòng)性改變、抗氧化酶活性增加及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累等［7－10］，以此來響應(yīng)外界溫度的迅猛降低和提高植株抵抗低溫傷害的能力。研究表明，脯氨酸（Pro）含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性等生理生化指標(biāo)的變化可作為評(píng)價(jià)小麥抗寒性高低的鑒定指標(biāo)［11－14］。小麥的抗寒性受眾多基因控制，因此將產(chǎn)量因子與抗寒性生理生化指標(biāo)結(jié)合起來進(jìn)行分析，可以更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)小麥品種的抗寒性。

漯麥163是以漯麥6010為母本、弗羅里達(dá)為父本雜交選育而成的小麥新品種，2018年通過湖北省審定（鄂審麥2018006），2020年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定（國審麥20200043）。漯麥163表現(xiàn)出豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性廣、綜合抗病性好、品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)［15，16］。目前關(guān)于冬小麥抗寒生理的研究已有不少報(bào)道［16，17］，但關(guān)于漯麥163的抗寒性研究卻是空白。本試驗(yàn)以漯麥163及其母本漯麥6010、鄭麥9023（對照）和偃展4110為材料，將其盆栽至拔節(jié)期，再通過春化室模擬低溫處理，研究拔節(jié)期低溫對不同品種小麥葉片生理生化特性的影響，并利用灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究低溫脅迫下小麥生理特性與產(chǎn)量的關(guān)系，尋找與產(chǎn)量性狀密切相關(guān)的生理指標(biāo)，以期為小麥品種抗寒性評(píng)價(jià)、生產(chǎn)上抗寒品種的選用和漯麥163的示范推廣提供理論依據(jù)，也為室內(nèi)快速鑒定冬小麥的抗寒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018—2019年在漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行。供試品種漯麥163、漯麥6010、鄭麥9023（對照）和偃展4110種子，由漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供，盆栽法種植。盆直徑30 cm，高60 cm，底部用網(wǎng)袋包裹，以保持下層土壤通氣良好。每盆裝入大田0～30 cm耕層土壤后埋入大田，盆內(nèi)土壤與地面持平。播前每盆施復(fù)合基肥6 g，澆透水沉實(shí)土壤后于10月15日播種，3葉期定苗，每盆留苗9株。每個(gè)品種種植9盆，其中3盆用于低溫取樣，3盆用于低溫脅迫后測產(chǎn)，3盆用于常溫對照，共計(jì)36盆。澆水量根據(jù)土壤墑情決定，每盆澆水量一致。其它管理措施同大田，2019年6月3日收獲。

1.2 低溫處理方法

2019年春季，各小麥品種植株生長至拔節(jié)期，取樣顯微鏡觀察幼穂分化進(jìn)入雌雄蕊原基分化期時(shí)，將6盆均移入春化室模擬春季低溫脅迫。春化室內(nèi)設(shè)置為白天0℃、夜間－4℃，誤差0.5℃，空氣相對濕度為70%。采用人工光源，光照時(shí)間為8∶00—18∶00。低溫處理0、1、2、3 d和4 d時(shí)取主莖最上部的展開葉用于生理生化指標(biāo)檢測，每個(gè)品種取3盆作為3個(gè)重復(fù)。各品種剩余3盆在低溫處理4 d后移至自然條件下，直至收獲。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

生理生化指標(biāo)測定：每個(gè)品種測定3次取平均值。丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸比色法［18］；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法［19］；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法［19］；過氧化氫酶（CAT）活性測定采用過氧化氫法［20］；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G－250比色法［18］；脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法［18］。

產(chǎn)量因子測定：低溫脅迫處理4 d后，將未取樣的盆栽小麥放置到大田原位置，自然條件下恢復(fù)生長。成熟后收獲，分別調(diào)查單株穗數(shù)、單株穗粒數(shù)和單株產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，利用DPS 15.10軟件進(jìn)行差異顯著性和灰色關(guān)聯(lián)度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對拔節(jié)期小麥葉片生理生化指標(biāo)的影響

2.1.1 對拔節(jié)期小麥葉片保護(hù)酶活性的影響 植物遭受逆境時(shí)，超氧陰離子自由基會(huì)大幅度增高，SOD是一種能消除活性氧對細(xì)胞膜損害的酶［21］。由圖1A可以看出，低溫脅迫后，各小麥品種葉片SOD活性不同程度地增加，且與常溫對照相比，均達(dá)到顯著水平；持續(xù)2 d低溫下，鄭麥9023和漯麥6010的SOD活性持續(xù)升高，但漯麥163和偃展4110出現(xiàn)不同程度的降低；低溫持續(xù)至第3天，漯麥163和偃展4110的SOD活性又上升，而鄭麥9023和漯麥6010下降。由此可見，不同品種的SOD活性對低溫的響應(yīng)能力存在差異，但均通過較大幅度的提高來抵抗低溫脅迫所造成的傷害，長期低溫脅迫下漯麥163和偃展4110表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性。

圖1 低溫脅迫下拔節(jié)期小麥葉片保護(hù)酶活性的變化

由圖1B可以看出，低溫脅迫后各品種的POD活性都有不同程度的增加，且漯麥6010和漯麥163與對照呈顯著差異；低溫脅迫2 d和3 d，各品種的POD活性持續(xù)增加；第4天，除鄭麥9023和偃展4110有所降低外，漯麥163和漯麥6010仍呈上升趨勢。說明持續(xù)低溫脅迫下，漯麥163和漯麥6010葉片的POD仍保持較強(qiáng)的抗氧化能力，而其它兩個(gè)品種的抗氧化能力稍有減弱。

由圖1C可以看出，低溫脅迫后4個(gè)小麥品種葉片CAT活性均有不同程度提高，與常溫對照相比，均達(dá)到顯著水平。其中低溫脅迫1 d，漯麥163升幅最大，為543.77%，其次為漯麥6010，為423.55%；低溫脅迫2 d，4個(gè)品種CAT活性均出現(xiàn)下降；至第3天，除漯麥6010繼續(xù)下降外，其余品種CAT活性開始回升；第4天時(shí)，除鄭麥9023和偃展4110外，漯麥6010和漯麥163的CAT活性均上升。這表明持續(xù)4 d低溫抑制了鄭麥9023和偃展4110清除活性氧的能力，但漯麥163和漯麥6010的CAT活性仍維持在較高水平，可將活性氧的傷害限制在一定的范圍內(nèi)。

2.1.2 對拔節(jié)期小麥葉片丙二醛含量的影響

由圖2可知，與常溫對照相比，低溫脅迫1 d，各品種小麥葉片的MDA含量均有不同程度的增加，且均差異顯著，其中漯麥6010增幅最大，為111.96%，漯麥163增幅最小，為46.16%；低溫處理2 d，除鄭麥9023上升外，其余品種MDA含量出現(xiàn)下降；低溫脅迫2、3 d和4 d，除偃展4110外，各品種與對照均差異顯著；低溫持續(xù)脅迫4 d，偃展4110的MDA含量出現(xiàn)下降，其它3個(gè)品種MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢。這表明低溫脅迫下，各品種植株已經(jīng)受到活性氧的傷害，但品種間受到的傷害程度不同。

圖2 低溫脅迫下拔節(jié)期小麥葉片丙二醛含量的變化

2.1.3 對拔節(jié)期小麥葉片可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響 由圖3A可知，低溫脅迫后，各品種的可溶性蛋白含量均呈增加趨勢。低溫處理1 d，除鄭麥9023外，其余3個(gè)品種可溶性蛋白含量與常溫對照相比，均顯著提高；第2天，鄭麥9023可溶性蛋白含量上升，其它3個(gè)品種下降；第3天和第4天，除鄭麥9023外，其余3個(gè)品種均緩慢增加。這說明在低溫脅迫下，小麥葉片積累了大量的可溶性蛋白，以保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，結(jié)果也表明鄭麥9023在低溫逆境下生成可溶性蛋白的能力稍弱些。

由圖3B可知，低溫脅迫下，4個(gè)小麥品種的脯氨酸含量呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢。低溫脅迫第1天，4個(gè)小麥品種脯氨酸含量與常溫對照相比，均有提高，除鄭麥9023外，其它3個(gè)品種差異顯著；低溫脅迫第2天至第4天，鄭麥9023和偃展4110脯氨酸含量沒有顯著變化；低溫脅迫第4天與第2天、第3天比，漯麥163脯氨酸含量變化差異顯著，漯麥6010低溫脅迫第4天與第3天的脯氨酸含量差異顯著。由此可以看出，在長期低溫脅迫下，漯麥163和漯麥6010表現(xiàn)出更強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力。

圖3 低溫脅迫下拔節(jié)期小麥葉片可溶性蛋白和脯氨酸含量的變化

2.2 拔節(jié)期低溫脅迫對小麥產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響

由表1可知，與自然溫度下的對照相比，拔節(jié)期低溫造成各品種小麥的成穗數(shù)、穗粒數(shù)和單株產(chǎn)量均顯著下降，不孕小穗數(shù)均顯著上升；結(jié)實(shí)小穗數(shù)除鄭麥9023與對照有顯著差異外，其余3個(gè)品種均無顯著差異；千粒重除漯麥6010與對照無顯著差異外，其余3個(gè)品種均顯著降低。單株減產(chǎn)率依次為鄭麥9023（49.79%）＞偃展4110（47.92%）＞漯麥163（44.06%）＞漯麥6010（38.99%）。以上結(jié)果說明，拔節(jié)期低溫脅迫對小麥成穗數(shù)和穗粒數(shù)影響顯著，單株穗數(shù)和穗粒數(shù)的變化幅度越小，單株產(chǎn)量減產(chǎn)越少。

表1 拔節(jié)期低溫脅迫對小麥產(chǎn)量性狀的影響

2.3 拔節(jié)期低溫脅迫下小麥生理生化特性與產(chǎn)量的灰色關(guān)聯(lián)度分析

由表2可以看出，拔節(jié)期低溫脅迫后，小麥各生理生化指標(biāo)增減幅與其產(chǎn)量降幅的關(guān)聯(lián)度大小依次為：脯氨酸含量＞可溶性蛋白含量＞MDA含量＞POD活性＞CAT活性＞SOD活性，其中SOD活性與產(chǎn)量的關(guān)聯(lián)度最小，關(guān)聯(lián)度為0.5604。說明小麥拔節(jié)期遭受低溫脅迫時(shí)，脯氨酸、可溶性蛋白、MDA含量和POD、CAT活性對小麥產(chǎn)量影響較大，與小麥拔節(jié)期耐寒性的關(guān)系密切。

表2 拔節(jié)期低溫脅迫下小麥各生理指標(biāo)與產(chǎn)量的關(guān)聯(lián)度及排序

3 討論與結(jié)論

低溫脅迫能夠使植物正常的生理代謝失去平衡，細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生會(huì)加快和增多，而活性氧清除系統(tǒng)又表現(xiàn)出相對較弱的清除能力，導(dǎo)致活性氧自由基在體內(nèi)大量積累，植株受到傷害。SOD、POD和CAT是植株防御體內(nèi)因活性氧自由基過多積累而造成細(xì)胞傷害的重要的保護(hù)性抗氧化酶類，能夠清除植物體內(nèi)具有潛在危害的氧負(fù)離子和過氧化氫。張勇等［22］研究指出，SOD、POD和CAT等抗氧化物酶活性的高低可以反映植物在低溫脅迫下抵御低溫逆境脅迫的能力；李春燕等［23］研究指出，小麥在苗期低溫脅迫下SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性的變化隨低溫脅迫的加劇呈先上升后降低的趨勢。本研究中，低溫脅迫1 d，各小麥品種葉片的SOD、POD和CAT活性均呈上升趨勢，表明在一定的低溫脅迫下，三種酶能夠保持協(xié)調(diào)一致，從而有效清除活性氧，保護(hù)植株免遭低溫傷害；持續(xù)2 d，各品種POD活性均上升，SOD和CAT活性則有升有降；持續(xù)3 d和4 d，漯麥163和漯麥6010的SOD、POD和CAT活性一直呈現(xiàn)上升趨勢，說明兩品種在長期低溫脅迫下能有效清除自由基，有較強(qiáng)的抗寒性，而鄭麥9023和偃展4110的SOD、POD和CAT活性呈下降趨勢（偃展4110的SOD活性除外），這可能與兩品種自身較弱的抗寒性有關(guān)，最終導(dǎo)致不能有效清除低溫脅迫造成的自由基升高。

SOD、POD和CAT作為植物體內(nèi)重要的保護(hù)性抗氧化酶類，相互協(xié)調(diào)及時(shí)清除多余的超氧陰離子自由基等活性氧，保護(hù)膜系統(tǒng)不受損傷。但當(dāng)保護(hù)酶的清除能力不足以清除多余的氧自由基時(shí)，就會(huì)引起膜脂不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化，最終形成有毒物質(zhì)MDA［24］。本試驗(yàn)中，除鄭麥9023外，低溫處理2 d，其它品種MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢，而到第3天又呈上升趨勢。這說明隨著低溫時(shí)間的持續(xù)延長，酶促系統(tǒng)已經(jīng)不能及時(shí)清除持續(xù)低溫造成的過量活性氧和自由基，從而導(dǎo)致MDA在植株體內(nèi)的積累。

低溫脅迫下，植物體內(nèi)脯氨酸含量的增加能夠提高植物的抗冷性，且小麥抗寒性隨脯氨酸含量的增加而增強(qiáng)［25］。低溫脅迫能夠引起小麥細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量的增加，可溶性蛋白含量與其抗寒性存在密切的正相關(guān)［26］。本研究中，低溫脅迫后，4個(gè)小麥品種的脯氨酸含量呈上升趨勢；低溫至第4天，除偃展4110外，其它3個(gè)品種的脯氨酸含量均呈增加趨勢，且漯麥163和漯麥6010的脯氨酸含量與第3天相比，差異達(dá)顯著水平，說明兩品種在低溫下能夠通過脯氨酸含量的增加來提高抗寒性?？扇苄缘鞍缀空w呈上升趨勢，隨著低溫脅迫時(shí)間延長，增量差異不顯著，但其值整體高于自然對照。

拔節(jié)期低溫可導(dǎo)致小麥成穗數(shù)和穗粒數(shù)顯著下降，不孕小穗數(shù)顯著上升，單株產(chǎn)量下降。本試驗(yàn)中，各個(gè)品種的單株產(chǎn)量減幅不同，說明不同品種耐拔節(jié)期低溫的特性存在差異?；疑P(guān)聯(lián)度分析表明，脯氨酸、可溶性蛋白、MDA含量和POD、CAT活性與產(chǎn)量的關(guān)聯(lián)度較高，可作為小麥耐寒性鑒定的重要指標(biāo)。

漯麥163是漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的小麥新品種，具有豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗寒性強(qiáng)、中抗赤霉病、抗倒性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)等特性。研究發(fā)現(xiàn)，漯麥163屬于抗寒性較強(qiáng)的品種，主要是因?yàn)椋孩倌副句瘥?010具有較強(qiáng)的抗寒性，豐富的遺傳基礎(chǔ)使得漯麥163具有較強(qiáng)的抗寒性；②持續(xù)低溫脅迫下，漯麥163的SOD、POD、CAT活性仍維持在較高水平，可以將活性氧的傷害限制在一定范圍內(nèi)，提高植物抗寒性；③長期低溫脅迫下，漯麥163的可溶性蛋白和脯氨酸含量顯著上升，表現(xiàn)出更強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力。本研究也可為漯麥163的示范推廣提供理論依據(jù)。