張悅美, 郭麗華, 李一峻, 何錫文, 陳朗星*, 張玉奎,2

(1.南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 生物傳感與分子識別天津市重點實驗室, 天津 300071; 2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023)

馬兜鈴酸是衍生自馬兜鈴科植物、結(jié)構(gòu)含有硝基菲羧酸基團的一類物質(zhì)。近十幾年來,以馬兜鈴酸為有效成分制成的各種藥物被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療,但是最近有報道[1-4]指出,含有馬兜鈴酸的植物或植物衍生產(chǎn)品對人具有腎毒性、致突變性和致癌性。因此為了維護人體的健康,需要監(jiān)測藥物中馬兜鈴酸的存在。目前馬兜鈴酸的測定方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法、毛細管電泳法等[5-9]。但是實際中藥樣品中馬兜鈴酸含量低,且中藥成分復(fù)雜,增加了馬兜鈴酸的檢測難度。因此開發(fā)合理的預(yù)處理方法對于從復(fù)雜中藥樣品中提取馬兜鈴酸十分必要。

分子印跡聚合物(MIPs)是一類對特定物質(zhì)具有特異性吸附的分離材料。近年來,分子印跡聚合物常作為吸附劑被用于藥物、環(huán)境污染物、獸藥的提取[10-13]。但是大多數(shù)MIPs采用傳統(tǒng)本體分子印跡方法制備而得,大部分印跡識別位點被包埋在內(nèi)部,導(dǎo)致其識別位點不均一,傳質(zhì)阻力大,動力學(xué)平衡慢。表面分子印跡技術(shù)由于印跡效率高、傳質(zhì)速率快成為分子印跡中應(yīng)用廣泛的技術(shù)。在表面分子印跡的基底中,SiO2膠體納米顆粒(SiO2NPs)表面富含羥基易于官能化反應(yīng),而且合成SiO2NPs的條件簡單、方法已經(jīng)十分成熟,另外SiO2NPs具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、機械強度較高、耐熱、耐腐蝕、無毒性且生物相容性較好等優(yōu)點,使其成為最常用的核-殼型分子印跡聚合物的核[14-16]。目前以馬兜鈴酸為模板的分子印跡聚合物的研究[9,17,18]報道不多。本課題組前期[9]采用簡便、綠色的溶膠-凝膠方法合成磁性碳納米管MIPs,并用于中藥中馬兜鈴酸Ⅰ(AAI)的檢測分析。Xiao等[17]采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)制備MIPs并用于AAI的去除。Ge等[18]合成一種磁性介孔碳分子印跡聚合物,并作為磁性固相萃取吸附劑選擇性識別大鼠尿液中的馬兜鈴酸Ⅰ和Ⅱ。

本工作以SiO2NPs為核,以AAI為模板分子,2-乙烯基吡啶(VPY)為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑,利用表面分子印跡的方法合成分子印跡聚合物包覆的SiO2納米顆粒(SiO2@MIP NPs)。將此SiO2@MIP NPs作為吸附劑,并與HPLC相結(jié)合,用于中藥中AAI的選擇性分離和識別。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SPD-M20A高效液相色譜儀(配置兩臺LC-20AD泵、一臺在線脫氣機DGU-20A5以及一個二極管陣列檢測器,色譜數(shù)據(jù)的采集和處理在LCsolution工作站完成)、UV-2450型紫外/可見分光光度計(日本島津公司); G2 F20透射電子顯微鏡(美國FEI公司); AVATAR 360傅里葉紅外光譜(美國Nicolet公司); NETZSCH-TG209C熱重分析儀(德國NETZSCN公司); ASAP 2460型N2吸附表面分析儀(美國麥克公司);實驗用高純水由AWL-0502-U艾科浦超純水系統(tǒng)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)提供。

AAI購自天津希恩思奧普德科技有限公司;丙烯酸(AA)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲基丙烯酸(MAA)購自天津艾利安電子科技有限公司;丙烯酰胺(AM)、甲基丙烯酰胺(MAM)、四乙氧基硅烷(TEOS)、甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(MPS)、EGDMA及偶氮二異丁腈(AIBN)購自阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司;2-甲氧基-5-硝基苯酚(MENP)購自北京華威銳科化工有限公司;丹參酮ⅡA(TAN ⅡA)和苯甲酸(BA)購自上海麥克林生化科技有限公司;VPY購自凱瑪特(天津)化工科技有限公司;中藥川木通購自安國新藥都藥材市場。其他化學(xué)試劑均為分析純及以上級別。

1.2 核-殼結(jié)構(gòu)馬兜鈴酸分子印跡聚合物納米顆粒的制備

1.2.1雙鍵修飾的SiO2NPs(SiO2@MPS NPs)的制備

利用傳統(tǒng)的St?ber法首先制備SiO2NPs[19]。具體步驟如下:量取170 mL無水乙醇至250 mL圓底燒瓶中,快速加入9.40 mL TEOS,磁力攪拌,轉(zhuǎn)速為600 r/min;油浴加熱至40 ℃,攪拌30 min后,用恒壓滴液漏斗將4.5 mL蒸餾水和12 mL氨水的混合液緩慢滴入燒瓶中,保持溫度反應(yīng)12 h,得到乳白色SiO2膠體納米顆粒分散液;將SiO2膠體納米顆粒分散液以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心,棄去上清液,離心產(chǎn)物再次分散到無水乙醇中,反復(fù)離心、分散循環(huán);最后一次離心得到SiO2NPs。

稱取400 mg SiO2NPs,加入到含有20 mL超純水和80 mL無水乙醇的三口燒瓶中,超聲30 min使SiO2NPs分散均勻;開啟機械攪拌,以500 r/min的轉(zhuǎn)速劇烈攪拌;依次加入3 mL氨水和1.6 mL MPS,置于65 ℃油浴中反應(yīng)24 h;所得白色產(chǎn)物以800 r/min的轉(zhuǎn)速離心,棄去上清液,離心產(chǎn)物反復(fù)用無水乙醇分散、離心循環(huán)3次,最后一次離心產(chǎn)物于40 ℃真空干燥6 h,得到SiO2@MPS NPs。

1.2.2SiO2@MIP NPs的制備

稱取13.6 mg(0.04 mmol)模板分子AAI,置于50 mL離心管中,加入40 mL甲醇,超聲溶解得到深黃色透明液體;在該溶液中加入0.16 mmol VPY,超聲進行預(yù)聚合;然后將100 mg SiO2@MPS NPs完全分散在上述溶液中;再將150 μL(0.8 mmol)EGDMA和20 mg AIBN轉(zhuǎn)移至離心管中,混合,將離心管中的液體全部轉(zhuǎn)移到100 mL三口燒瓶中,冰浴中通入N2除氧,持續(xù)30 min;除氧后將三口燒瓶密封好,磁力攪拌800 r/min,油浴加熱,于50 ℃預(yù)聚合1 h,于60 ℃反應(yīng)24 h,得到的產(chǎn)物為乳黃色懸濁液。將產(chǎn)物離心分離,棄去上清液,離心產(chǎn)物用甲醇重新分散并再次離心分離,上述過程重復(fù)直至上清液在320 nm下無紫外吸收,證明已經(jīng)除去模板分子AAI;將最終所得產(chǎn)物于40 ℃真空干燥6 h,最終得到SiO2@MIP NPs。

作為對照,用同樣的方法合成非印跡聚合物SiO2@NIP NPs,只是不加入模板分子AAI。

1.3 SiO2@MIP NPs選擇吸附性能的研究

將5 mg SiO2@MIP NPs分別置于1.5 mL含不同濃度AAI的乙腈溶液中,超聲2 min使NPs完全分散，振蕩10 min;隨后以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速高速離心,于320 nm處用紫外可見分光光度計測定上清液中AAI濃度,計算SiO2@MIP NPs的吸附容量。

選擇TAN ⅡA、BA、MENP作為馬兜鈴酸的結(jié)構(gòu)類似物進行SiO2@MIP NPs選擇性吸附的探究。分別配制1.5 mL含25.0 μg/mLTAN ⅡA、BA、MENP和AAI的乙腈溶液。稱取5 mg SiO2@MIP NPs置于上述4種溶液中,超聲2 min充分分散后,于室溫振蕩10 min,高速離心后取上清液用紫外可見分光光度計測定吸光度并計算吸附容量。

1.4 SiO2@MIP NPs在中藥實際樣品中的應(yīng)用

參照Li等[9]的方法,稱取川木通粉末1 g,置于250 mL單口燒瓶中,加入80 mL甲醇和20 mL超純水,于80 ℃下回流3 h,收集回流液,重新加入80 mL甲醇、20 mL超純水后,再次于80 ℃回流3 h。重復(fù)4個循環(huán),將所有回流液經(jīng)過旋蒸后得到棕黃色固體。棕黃色固體超聲分散在20 mL甲醇(色譜純)中,離心除去不能溶解的固體,提取液經(jīng)0.1 μm有機微孔濾膜過濾后進行HPLC檢測。

1.5 分析條件

色譜柱為Shim-pack VP-ODS C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm),柱溫為25 ℃,流動相為甲醇-0.1%乙酸水溶液(3∶1, v/v),等度洗脫,流速為0.5 mL/min,檢測波長為320 nm,進樣量為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 SiO2@MIP NPs制備條件的優(yōu)化

SiO2@MIP NPs的制備過程如圖1所示。先以St?ber法[19]合成SiO2NPs,然后以含有雙鍵的硅烷試劑MPS為反應(yīng)物,經(jīng)過溶膠-凝膠反應(yīng)在SiO2NPs表面形成雙鍵基團,即可與功能單體作用,SiO2NPs作為載體,具有較小的粒徑和較高的比表面積,更易于對模板分子的吸附。待模板分子洗脫后,得到表面含有印跡位點的SiO2@MIP NPs。

圖1 SiO2@MIP NPs合成示意圖

在進行分子印跡的過程中,模板分子和功能單體之間作用力越強,越有利于二者形成預(yù)聚合混合物后的印跡過程。因此選擇合適的功能單體,對提高印跡效果十分重要。AAI的分子結(jié)構(gòu)中具有羧基,因而呈現(xiàn)一定的酸性。AA和MAA屬于酸性的功能單體,與同樣呈現(xiàn)酸性的AAI之間的結(jié)合力較弱;AM和MAM的結(jié)構(gòu)中有氨基,而氨基具有吸電子能力,因此可以與AAI中的羧基通過氫鍵、靜電作用形成可逆的復(fù)合物;VPY作為堿性功能單體中的一種,其吡啶環(huán)上的氮原子帶有正電荷離子,可與羧基中的氫離子發(fā)生靜電作用,所以理論上VPY更適合作為印跡AAI的功能單體。

從功能單體AA、MAA、AM、MAM、VPY分別與AAI混合的預(yù)聚合溶液的紫外可見光譜圖發(fā)現(xiàn),在功能單體與模板分子比例相同時,VPY與AAI的混合液在250 nm的吸光度較AAI溶液的吸光度下降的最多(見圖2a),說明VPY更容易與AAI形成穩(wěn)定的復(fù)合物。為了進一步驗證功能單體與AAI的作用,選取VPY按照不同的物質(zhì)的量之比與AAI混合,當增加VPY的物質(zhì)的量時,功能單體與模板分子的混合溶液的吸光度隨之下降(見圖2b),而AAI和AA的混合溶液的吸光度隨AA物質(zhì)的量的增加并沒有發(fā)生明顯的變化(見圖2c),實驗結(jié)果進一步證明了VPY與AAI具有強的非共價作用力。因此,在后續(xù)實驗中選擇VPY作為功能單體。

圖2 馬兜鈴酸和不同功能單體混合溶液的紫外可見光譜圖

2.2 SiO2@MIP NPs的性能表征

采用透射電子顯微鏡對合成的SiO2NPs和SiO2@MIP NPs進行形貌表征。如圖3所示,SiO2NPs和SiO2@MIP NPs呈規(guī)整的球形結(jié)構(gòu),表明表面印跡后球形形貌得到了保留,較大的比表面積有利于后續(xù)較快的傳質(zhì)過程。SiO2NPs粒徑約為200 nm,微球大小均一,具有很好的單分散性(見圖3a)。制備的SiO2@MIP NPs呈明顯的核-殼結(jié)構(gòu),SiO2膠體納米顆粒核完全被印跡聚合物殼層包裹(見圖3b),表明在SiO2膠體微球表面成功包覆上了印跡聚合物,得到的印跡層包裹均勻,厚度約為35 nm。

圖3 (a)SiO2 NPs和(b)SiO2@MIP NPs的透射電鏡圖

通過傅立葉變換紅外光譜儀的測定,得到了SiO2NPs、SiO2@MPS NPs和SiO2@MIP NPs表面官能團分布的信息。圖4a中3條FT-IR譜圖中均在1 089 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰,對應(yīng)Si-O-Si的不對稱伸縮振動峰;3 430 cm-1處出現(xiàn)的寬峰是由Si-OH的伸縮振動引起。在SiO2@MPS NPs的譜圖中,在1 623 cm-1和1 708 cm-1處出現(xiàn)了新特征峰,分別對應(yīng)MPS中C=C振動峰和C=O振動峰,說明已經(jīng)成功在SiO2膠體微球表面修飾雙鍵。在SiO2@MIP NPs譜圖中,1 461 cm-1處的吸收峰與EGDMA中與醚鍵相連的亞甲基中C-H的特征振動有關(guān);2 935 cm-1處的吸收峰對應(yīng)著飽和C-H伸縮振動峰;與SiO2@MPS NPs譜圖相比,由于EGDMA中C=O的引入,使得SiO2@MIP NPs譜圖中C=O的吸收峰強度大大增加;在SiO2@MIP NPs譜圖中C=C峰強度也有所降低,是由于SiO2@MPS NPs表面上的C=C與功能單體VPY、交聯(lián)劑EGDMA進行了共聚反應(yīng)。

圖4 SiO2 NPs、SiO2@MPS NPs和SiO2@MIP NPs的(a)傅里葉紅外譜圖和(b)熱重分析譜圖

利用熱重分析儀分析了SiO2NPs、SiO2@MPS NPs、SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs的熱穩(wěn)定性,結(jié)果進一步證實SiO2NPs表面成功包裹了聚合物。圖4b的熱重分析結(jié)果顯示SiO2NPs失重約為15%,歸因于SiO2NPs所含水分的蒸發(fā)和表面羥基的分解;SiO2@MPS NPs約有19%的失重,比SiO2NPs的失重增加了約4%,歸因于硅球表面成功接枝的雙鍵;SiO2@MIP NPs從300 ℃開始發(fā)生明顯的失重,失重約56%,比SiO2@MPS NPs增加了約37%,這歸因于表面分子印跡層的分解,進一步證明了硅球表面聚合物層的存在;SiO2@NIP NPs從300 ℃開始也存在明顯的失重,失重約為60%,略高于SiO2@MIP NPs。在500 ℃之后,SiO2NPs、SiO2@MPS NPs、SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs沒有繼續(xù)發(fā)生明顯的失重,說明材料均具備熱穩(wěn)定性。

對SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs進行了比表面積和孔徑的分析。SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs的N2吸附-脫附曲線非常類似(見圖5),說明二者的物理吸附?jīng)]有太大差別。采用Brunauer-Emmett-Teller(BET)方程和Barrett-Joyner-Halenda(BJH)方法分析了SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs的比表面積和孔徑分布參數(shù),SiO2@MIP NPs的比表面積(15.56 m2/g)稍微高于SiO2@NIP NPs的比表面積(14.49 m2/g),二者的孔徑大小相同(1.590 nm), SiO2@MIP NPs的孔容(0.018 20 cm3/g)略大于SiO2@NIP NPs(0.017 65 cm3/g)。結(jié)合熱重分析結(jié)果,說明SiO2@NIP NPs表面包覆上了更多的聚合物。因此,可以認為MIPs表面的印跡位點是導(dǎo)致吸附差異的主要原因,而不是由于制備材料比表面積的不同。

圖5 SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs的N2吸附-脫附等溫曲線

2.3 SiO2@MIP NPs的吸附性能

SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs對馬兜鈴酸的動力學(xué)吸附如圖6a所示。從圖中可以看出,吸附劑的吸附量隨著時間的增加逐漸增大,前60 s吸附量增加明顯,歸因于吸附劑表面的印跡位點尚未被完全占據(jù);在大約120 s時吸附量基本保持不變,證明達到了吸附平衡。快速的吸附平衡證明了采用表面印跡方法合成的SiO2@MIP NPs具有快速的傳質(zhì)過程和結(jié)合能力。此外,還觀察到SiO2@MIP NPs的吸附量明顯大于SiO2@NIP NPs,說明相比于SiO2@NIP NPs的非特異性吸附,SiO2@MIP NPs的特異性吸附發(fā)揮了作用。

圖6 SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs的(a)動力學(xué)吸附曲線和(b)熱力學(xué)吸附曲線(n=3)

為了進一步研究所制備印跡材料的吸附性能,SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs對不同初始濃度AAI標準溶液進行了等溫吸附平衡實驗,從圖6b中可以觀察到,SiO2@MIP NPs出現(xiàn)吸附平衡時對應(yīng)的AAI濃度較高,且SiO2@MIP NPs的吸附量明顯大于SiO2@NIP NPs,這也印證了SiO2@MIP NPs具有與AAI相匹配的特異性識別位點,能夠結(jié)合更多的AAI。對SiO2@MIP NPs的熱力學(xué)吸附曲線分別做了Langmuir擬合和Freundlich擬合,二者均具有較高的擬合程度,可能是因為SiO2@MIP NPs除了依靠氫鍵結(jié)合AAI外,還有離子間相互作用。由于Langmuir擬合(r=0.996 6)優(yōu)于Freundlich擬合(r=0.993 3),因此推斷吸附劑的吸附行為為單分子層吸附,主要發(fā)生在吸附劑的表面且吸附劑具有均勻的與AAI相匹配的結(jié)合位點。根據(jù)Langmuir擬合方程,得出理論最大吸附量為5.74 mg/g。

在實際中藥樣品分析中,復(fù)雜的基質(zhì)干擾往往會影響分子印跡聚合物的識別結(jié)果。因此,在識別過程中需要分子印跡聚合物具有較好的選擇性。根據(jù)AAI的分子結(jié)構(gòu),實驗分別選擇了具有多苯環(huán)結(jié)構(gòu)的丹參酮ⅡA,具有硝基的2-甲氧基-5-硝基苯酚和具有酸性的苯甲酸作為AAI的結(jié)構(gòu)類似物。SiO2@MIP NPs的吸附選擇性通過目標物在印跡聚合物顆粒和溶液之間的分配系數(shù)(K)、印跡因子(IF)和選擇性系數(shù)(SC)來評價[20]。實驗結(jié)果表明，SiO2@MIP NPs具有高的印跡因子(4.9),對模板結(jié)構(gòu)類似物有較好的選擇性,選擇系數(shù)為2.3～6.6。

對比SiO2@MIP NPs或SiO2@NIP NPs對AAI及其結(jié)構(gòu)類似物吸附的結(jié)果(見圖7),發(fā)現(xiàn)SiO2@MIP NPs對模板分子AAI的吸附量顯著高于其他3種類似物,此外對AAI的IF也比其他類似物更高,這表明SiO2@MIP NPs表面的印跡層具有特定的識別位點,這些位點在大小、形狀和功能基團方面都能夠和AAI匹配互補,因而模板AAI能夠比其他3種類似物更容易占據(jù)所形成的空腔。在3種結(jié)構(gòu)類似物中,無論SiO2@NIP NPs還是SiO2@MIP NPs,對苯甲酸的吸附量均較高,這可能是因為苯甲酸中的羧基和功能單體VPY有類似于AAI和VPY之間的離子間作用力,因此導(dǎo)致了較高的非特異性吸附。對比SiO2@NIP NPs對AAI、TAN ⅡA、BA和MENP的吸附量，可以發(fā)現(xiàn)SiO2@NIP NPs對AAI的吸附量最高。這一實驗結(jié)果與Baggiani等[21]的報道一致,即如果NIP與目標分子也有結(jié)合特性,則同樣方法合成的MIP表現(xiàn)出的印跡效應(yīng)將更為顯著。

圖7 SiO2@MIP NPs和SiO2@NIP NPs對AAI、TANⅡA、BA和MENP的吸附容量(n=3)

樣品預(yù)處理吸附劑的一個顯著特點是具有良好的可重復(fù)使用性。因此,研究制備的分子印跡材料的再生能力具有重要意義。以1%乙酸甲醇溶液為洗脫液,進行了5次吸附-再生循環(huán)吸附試驗,發(fā)現(xiàn)SiO2@MIP NPs對AAI在5次吸附循環(huán)后,其吸附量與第一次相比損失了約16%。這是因為隨著洗脫次數(shù)的增加,印跡聚合物表面的特異性結(jié)合位點有可能被破壞。經(jīng)過5次吸附-再生循環(huán)吸附試驗,印跡聚合物的吸附容量雖有降低,但是仍然超過第1次吸附容量的80%,可以認為所制備的印跡聚合物材料具有良好的重復(fù)使用性能,可作為吸附劑用于實際樣品中AAI的富集和檢測分析。

2.4 SiO2@MIP NPs對AAI的選擇性吸附

將制備的SiO2@MIP NPs用作吸附劑并結(jié)合HPLC對加標中藥川木通樣品進行分析。在0.050～200.0 μg/mL范圍內(nèi),AAI濃度與其色譜峰面積具有較好的線性關(guān)系(r=0.999 9),該方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.033 μg/mL和0.11 μg/mL。加入AAI到川木通提取液中,使AAI的加標水平分別為0.3、0.5和1.0 μg/mL,通過HPLC檢測,發(fā)現(xiàn)AAI的加標回收率為73%～83%,相對標準偏差(RSD)小于3.5%。

將SiO2@MIP NPs加入到中藥川木通的提取液中,分析后,相應(yīng)的色譜圖如圖8所示。沒有加AAI的川木通樣品在保留時間為17.5 min處沒有出現(xiàn)色譜峰;而加標1 μg/mL的AAI川木通樣品中出現(xiàn)了AAI的色譜峰;用SiO2@MIP NPs吸附劑對加標的川木通樣品進行吸附后,發(fā)現(xiàn)AAI的色譜峰消失,這證明合成的SiO2@MIP NPs具有對AAI的特異性吸附,并能夠用于中藥樣品中AAI的選擇性去除。

圖8 川木通提取液的色譜圖

3 結(jié)論

本工作采用表面分子印跡技術(shù)制備了核-殼結(jié)構(gòu)的馬兜鈴酸分子印跡聚合物,并作為吸附劑應(yīng)用于中藥川木通中AAI的選擇性去除。一系列吸附實驗表明,制備的分子印跡聚合物對AAI的吸附平衡時間短、吸附容量理想、選擇性高。本文建立了SiO2@MIP NPs作為吸附劑的HPLC方法,并應(yīng)用于中藥中馬兜鈴酸的選擇性分離分析。基于核-殼結(jié)構(gòu)SiO2@MIP NPs,可作為高選擇性材料用于中藥有效成分的分離富集和化學(xué)危害物質(zhì)的去除。