張維冰, 盧 睿, 張凌怡

(華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237)

外泌體(exosomes)是一種幾乎所有細(xì)胞都分泌的細(xì)胞外囊泡,尺寸為30～150 nm,具有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu),其表面富含多種蛋白質(zhì),其內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和代謝物[1,2]。外泌體是來源細(xì)胞、鄰近細(xì)胞以及遠(yuǎn)處組織的通訊介體,是癌癥信息的寶貴載體[3-8],其在體液中廣泛存在,含量豐富且易于獲取[9],故收集由腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體已成為腫瘤液體活檢的主要方向之一[10]。為保證液體活檢結(jié)果的可重復(fù)性和一致性,需發(fā)展從復(fù)雜樣品中富集具有足夠產(chǎn)量和純度的外泌體方法。目前基于外泌體的尺寸、疏水性蛋白和特征蛋白發(fā)展了對(duì)應(yīng)的外泌體分離純化方法,如超速離心法、聚合物沉淀法和免疫親和法等[11-14]。其中,超速離心法是外泌體研究領(lǐng)域公認(rèn)的“金方法”,該法需進(jìn)行多次高速離心,且需要昂貴的超速離心機(jī),所得外泌體產(chǎn)量低、純度高[15]。

適配體(aptamers, Apt)是一段總長為20～100 nt的寡核苷酸鏈,表現(xiàn)出配體結(jié)合特性,可用于在nmol水平上檢測不同類型的藥物和生物分子,被稱為化學(xué)抗體[16-19]。適配體的識(shí)別特性來自于特定序列(基因型)和折疊成具有特定功能(表型)的不同形狀[20]。除了適配體特定的結(jié)構(gòu)組成,氫鍵、范德華力、π共軛效應(yīng)和靜電相互作用等非共價(jià)相互作用也穩(wěn)定了靶分子-適配體復(fù)合物[21]。相較于抗體,適配體成本低,易于合成及化學(xué)修飾,可重復(fù)使用[22,23]。外泌體表面的特征蛋白如跨膜蛋白CD63、CD9、CD81常被作為外泌體的標(biāo)記[24],其中CD63是被使用最多的外泌體標(biāo)記[25]。目前,已有文獻(xiàn)[26,27]報(bào)道多種靶向外泌體特征蛋白的適配體序列。以外泌體特征蛋白作為鑒定靶標(biāo),適配體已廣泛應(yīng)用于外泌體檢測[25,28-32]。Zhang等[33]制備了CD63適配體修飾的磁性納米材料,可以在15 min內(nèi)快速捕獲且無損釋放外泌體。Xie等[34]制備了表面帶正電荷的介孔二氧化硅納米材料,并在材料表面修飾表皮生長因子受體(EGFR)適配體,用于結(jié)合人肺癌細(xì)胞A549中高表達(dá)EGFR的外泌體,并將血液中致癌性的外泌體從小腸代謝出去。

鋯、鈦金屬離子及其氧化物對(duì)外泌體表面磷脂雙層具有高親和力,被應(yīng)用于外泌體的分離純化。Sun等[35]制備了修飾鈦離子和磷脂衍生物的雙功能磁珠,鈦離子與外泌體磷脂雙層膜結(jié)合,磷脂衍生物可以插入外泌體膜內(nèi),兩者協(xié)同實(shí)現(xiàn)尿液中外泌體的快速分離和有效富集。Zhang等[36]制備了Fe3O4@TiO2-DNA aptamer,并將其應(yīng)用于快速分離尿液中的外泌體,該材料結(jié)合了TiO2和外泌體磷脂雙層膜親和作用與適配體和外泌體表面目標(biāo)膜蛋白特異性相互作用,能夠在10 min內(nèi)捕獲尿液中92.6%的外泌體,經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到999個(gè)蛋白質(zhì)。Zhang等[37]制備了鋯基金屬有機(jī)框架(MOFs)材料Fe3O4@PDA@UiO-66-NH2,并將其應(yīng)用于外泌體和外泌體中磷酸化蛋白的連續(xù)富集,鑒定到來自255個(gè)磷酸化蛋白的707條磷酸化肽。MOFs材料是一類由金屬離子或金屬簇與有機(jī)配體通過配位鍵形成的有機(jī)-無機(jī)雜化材料。鋯基和鈦基MOFs材料可以提供豐富的金屬氧化物親和位點(diǎn)與磷脂雙層作用。MOFs材料多樣的有機(jī)配體可提供豐富的修飾位點(diǎn),如5′端修飾有-COOH的適配體可與MOFs材料有機(jī)配體中的-NH2共價(jià)結(jié)合,便于制備適配體修飾的MOFs材料。

本文以3種具有豐富金屬氧化物位點(diǎn)的磁性納米材料Fe3O4@Zr-MOFs、Fe3O4@Zr-Ti-MOFs和Fe3O4@TiO2為基底,以不同質(zhì)量的基底磁性納米材料修飾相同質(zhì)量的CD63適配體,制備了3類(6種)雙功能磁性納米材料。制備的雙功能材料可以充分結(jié)合核酸適配體親和的高選擇性和金屬氧化物的高富集容量優(yōu)勢,利用適配體與外泌體膜蛋白CD63和金屬氧化物親和位點(diǎn)與磷脂雙層膜間存在特異性相互作用,實(shí)現(xiàn)尿液中外泌體的分離純化。本文對(duì)比研究了上述6種雙功能磁性納米材料及相應(yīng)的3種基底磁性納米材料分離純化尿液外泌體的差異,并與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，高金屬氧化物含量的3種雙功能磁性納米材料的富集性能更優(yōu)異,高金屬氧化物有助于提高富集容量,而適配體的引入提高了材料捕集外泌體的選擇性,雙功能材料更適用于復(fù)雜樣品中外泌體的分離純化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

X型能譜儀(APOLLO, EDAX,美國)、透射電子顯微鏡(JEM-1400, JEOL,日本)、Zeta View納米顆粒跟蹤儀(PMX110, Particle Metrix,德國)、超速離心機(jī)(CP80MX, Hitachi,日本)、nano LC-MS/MS質(zhì)譜儀(Easy nLC1000 System, Thermo Fisher Scientific,德國)。

CD63-COOH適配體(COOH-5′-CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TA-3′)、CD63-SH適配體(5′-CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TA-3′-C6 SH)購于生工生物工程(上海)股份有限公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、氯化鋯(ZrCl4, 純度98%)、四氯雙(四氫呋喃)合鈦(IV)(TiCl4(THF)2, 純度98%)、鈦酸四丁酯(TBOT)、2-氨基對(duì)苯二甲酸(H2BDC-NH2)、六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、無水乙酸鈉(NaAc)、氨水(NH3·H2O)、乙二醇(EG)、甲酸(FA)、乙腈(ACN)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇(EtOH)均購于上海阿拉丁試劑有限公司;尿素(urea)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、硫脲(thiourea)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒P0011購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;二硫蘇糖醇(DTT, 純度99%)、碘代乙酰胺(IAA, 純度99%)、胰蛋白酶(trypsin)、Millipore超濾管(3 000 MWCO/100 000 MWCO)、0.22 μm無菌濾膜均購于美國Sigma Aldrich公司;尿液由3名健康志愿者(24～25歲女性)提供,所有采集的健康志愿者均與提供者簽署了書面知情同意書,并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 磁性納米材料的制備

1.2.1基底磁性納米材料的制備

稱取2.7 g FeCl3·6H2O和7.2 g NaAc,均勻分散于100 mL EG中,機(jī)械攪拌30 min,將溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中,于200 ℃反應(yīng)8 h,清洗烘干得Fe3O4顆粒。

稱取50 mg Fe3O4顆粒、75 mg ZrCl4和58 mg H2BDC-NH2，均勻分散于36 mL DMF中,將溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中,于120 ℃反應(yīng)24 h,所得顆粒清洗烘干得Fe3O4@Zr-MOFs。

Fe3O4@Zr-Ti-MOFs的制備參考本課題組之前的工作[38],稱取200 mg Fe3O4顆粒,分散于50 mL 含0.015 mol/L的ZrCl4的DMF溶液中,于120 ℃機(jī)械攪拌30 min,所得顆粒用DMF清洗3次,再分散于50 mL含0.015 mol/L H2BDC-NH2的DMF溶液中,于120 ℃機(jī)械攪拌1 h,所得顆粒用DMF清洗3次,得到Fe3O4@(Zr-MOFs)-NH2;將Fe3O4@(Zr-MOFs)-NH2分散于50 mL含0.015 mol/L的TiCl4(THF)2的DMF溶液中,于120 ℃機(jī)械攪拌30 min,所得顆粒用DMF清洗3次,再分散于50 mL含0.015 mol/L H2BDC-NH2的DMF溶液中,于120 ℃機(jī)械攪拌1 h,所得顆粒用DMF清洗3次,得到Fe3O4@(Zr-Ti-MOFs)1-NH2。上述步驟重復(fù)10次得Fe3O4@Zr-Ti-MOFs。

稱取50 mg Fe3O4顆粒,分散于90 mL EtOH、30 mL ACN和0.5 mL NH3·H2O混合溶液中,超聲5 min后逐滴加入1 mL TBOT,于室溫下機(jī)械攪拌1.5 h,磁分離去除上清液,顆粒重新均勻分散于40 mL EtOH和20 mL H2O溶液中,再將溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中,于160 ℃反應(yīng)20 h,得到Fe3O4@TiO2。

1.2.2雙功能磁性納米材料的制備

吸取15 μL 100 μmol/L CD63-COOH適配體于85 μL含400 mmol/L EDC、100 mmol/L NHS的10 mmol/L Tris緩沖鹽溶液(TBS緩沖液,pH=5)中活化1 h。在相同的適配體緩沖液中分別加入3 mg和4 mg Fe3O4@Zr-MOFs,孵育過夜,用TBS緩沖液清洗材料,得到Fe3O4@Zr-MOFs-Apt-1和Fe3O4@Zr-MOFs-Apt-2,將其保存于TBS緩沖液中,于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

吸取15 μL 100 μmol/L CD63-SH適配體和15 μL 10 mmol/L TCEP溶液,于60 μL 10 mmol/L TBS緩沖液(pH=5)中活化1 h。在相同的適配體緩沖液中分別加入1.5 mg Fe3O4@Zr-Ti-MOFs、2 mg Fe3O4@Zr-Ti-MOFs、3 mg Fe3O4@TiO2和4 mg Fe3O4@TiO2,孵育過夜,用TBS緩沖液清洗材料,得到Fe3O4@Zr-Ti-MOFs-Apt-1、Fe3O4@Zr-Ti-MOFs-Apt-2、Fe3O4@TiO2-Apt-1和Fe3O4@TiO2-Apt-2,將其保存于TBS緩沖液中,于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 尿液樣品前處理

收集志愿者的中段晨尿共計(jì)400 mL,以4 ℃ 2 000 g離心20 min,用0.22 μm無菌濾膜過濾上清液,以去除細(xì)胞碎片和大量凋亡小體。最后用超濾管(100 000 MWCO)濃縮濾液得到預(yù)處理后的尿液,于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

用超速離心法提取尿液中的外泌體,將預(yù)處理后的尿液以4 ℃ 10 000 g離心30 min去除沉淀微囊泡,取上清液在150 000 g下離心2 h,得到外泌體沉淀。棄上清,用TBS緩沖液清洗外泌體沉淀以除去干擾蛋白質(zhì),再以150 000 g離心2 h,得到外泌體沉淀,沉淀重懸于TBS緩沖液,并作為模型外泌體于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 外泌體富集及外泌體蛋白酶解

將磁性納米材料分散于50 μL TBS緩沖液中,加入20 μL 0.5 g/L的模型外泌體或200 μL預(yù)處理后的尿液,于4 ℃孵育15 min,磁分離去除上清液。用TBS緩沖液清洗材料并重懸材料,再加入100 μL尿素裂解液(8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、1 mmol/L苯甲基磺酰氟),冰浴超聲30 min,磁分離取上清液得裂解后的外泌體蛋白溶液。用超濾管(3 000 MWCO)將上清液置換為10 mmol/L DTT,于56 ℃水浴中還原1 h,再將溶液置換為25 mmol/L IAA,于暗處烷基化0.5 h,再將溶液置換為50 mmol/L NH4HCO3(pH=8.3)。加入適量胰蛋白酶(酶和蛋白質(zhì)質(zhì)量比1∶40),于37 ℃酶解17 h。酶解后的肽段經(jīng)除鹽凍干,于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)超速離心法提取的模型外泌體直接裂解,吸取100 μL尿素裂解液移至20 μL 0.5 g/L模型外泌體中,冰浴超聲30 min得到模型外泌體蛋白溶液。模型外泌體蛋白酶解步驟同上。

1.5 分析條件

nano LC-MS/MS分析外泌體蛋白色譜條件:ReproSil-Pur C18-AQ柱(75 μm×12 cm, 3 μm);流動(dòng)相A為0.1% FA水溶液,流動(dòng)相B為0.1% FA乙腈溶液。梯度洗脫條件為:0～8 min, 5%B～8%B; 8～58 min, 8%B～22%B; 58～70 min, 22%B～32%B; 70～71 min, 32%B～95%B; 71～78 min, 95%B。通過搜索MaxQuant數(shù)據(jù)庫鑒定外泌體蛋白。

2 結(jié)果與討論

2.1 外泌體的表征

采用透射電子顯微鏡、免疫印跡和納米顆粒追蹤分析對(duì)超速離心法提取的模型外泌體進(jìn)行表征。由透射電鏡圖(見圖1a)可以看出,外泌體形貌呈“茶托形”,體現(xiàn)了外泌體的雙層囊膜結(jié)構(gòu),其粒徑大小在30～150 nm范圍內(nèi)。采用納米顆粒追蹤分析表征外泌體濃度和粒徑,其含量為2.1×1012顆粒/mL,平均直徑為108.1 nm(見圖1b)。在外泌體中加入適量尿素緩沖液提取外泌體蛋白,用免疫印跡檢驗(yàn)是否存在外泌體標(biāo)志性蛋白TSG101和CD9,可見兩種標(biāo)志性蛋白均有表達(dá)(見圖1c)。另外采用BCA蛋白質(zhì)定量法測定外泌體蛋白含量,從400 mL尿液中提取到176 μg外泌體蛋白。

圖1 尿液外泌體的(a)透射電鏡圖、(b)粒徑分布和(c)標(biāo)志性外泌體蛋白TSG101與CD9的表達(dá)

2.2 雙功能磁性納米材料的制備與表征

通過X射線能譜儀表征磁性納米材料中Zr和Ti元素的含量(見表1)。Fe3O4@Zr-MOFs中Zr元素的質(zhì)量百分比為18.65%; Fe3O4@Zr-Ti-MOFs中Zr和Ti元素的質(zhì)量百分比分別為25.52%和9.65%; Fe3O4@TiO2中Ti元素的質(zhì)量百分比為23.65%。表明基底磁性納米材料可為外泌體捕集提供豐富的金屬氧化物親和位點(diǎn)。

表1 磁性納米材料的基本性質(zhì)

在制備雙功能磁性納米材料時(shí),增加基底磁性納米材料用量會(huì)引入更多的金屬氧化物親和基團(tuán)。為探究金屬氧化物親和位點(diǎn)和適配體在特異性富集外泌體中的作用差異,以不同質(zhì)量的基底磁性納米材料結(jié)合相同質(zhì)量的CD63適配體,得到6種雙功能磁性納米材料,其基本性質(zhì)列于表1。

CD63適配體是一段寡核苷酸序列,核酸在260 nm處存在紫外吸收,可通過高效液相色譜分析反應(yīng)上清液中CD63適配體殘余量,監(jiān)測適配體與磁性顆粒結(jié)合反應(yīng)進(jìn)程(見圖S1,詳見http://www.chrom-China.com)。適配體充分反應(yīng)后,上清液中CD63適配體峰消失,可以認(rèn)為加入的14.67 μg CD63適配體與不同質(zhì)量磁性顆粒充分結(jié)合。制備的6種雙功能磁性納米材料中CD63適配體總量保持一致。

2.3 模型外泌體的富集

以超速離心法提取的外泌體為模型樣品評(píng)價(jià)磁性納米材料捕集外泌體的能力,考察金屬氧化物親和位點(diǎn)和CD63適配體對(duì)富集效果的影響。

使用雙功能磁性納米材料富集模型外泌體時(shí),采用在線裂解的方法獲取材料富集的外泌體蛋白,即在完成富集的磁性材料中加入變性劑尿素,破壞CD63-CD63適配體復(fù)合物,洗脫捕獲的外泌體。同時(shí)尿素裂解液會(huì)破壞外泌體的囊泡結(jié)構(gòu)，釋放其內(nèi)部的蛋白質(zhì)，磁分離得到的上清液即為外泌體蛋白溶液。使用基底磁性納米材料富集模型外泌體時(shí),同樣采取在線裂解的方式,加入尿素緩沖液破壞外泌體囊泡結(jié)構(gòu),得到外泌體蛋白溶液。將得到的外泌體蛋白酶解除鹽,進(jìn)行nano LC-MS/MS分析。本文在相同條件下,分別采用制備的6種雙功能磁性納米材料和相應(yīng)的3種基底磁性納米材料對(duì)模型外泌體以及尿液外泌體進(jìn)行捕集。

根據(jù)nano LC-MS/MS分析結(jié)果對(duì)比研究6種雙功能磁性納米材料和相應(yīng)的3種基底磁性納米材料富集模型外泌體的差異。表2列出上述9種材料富集模型外泌體所得蛋白質(zhì)及模型外泌體直接裂解所得蛋白質(zhì)的個(gè)數(shù),將質(zhì)譜鑒定到的蛋白質(zhì)與Vesiclepedia外泌體數(shù)據(jù)庫(http://www.microvesicles.org/)對(duì)比,列出歸屬于外泌體的蛋白質(zhì)個(gè)數(shù),蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息列于表S1～表S10。

表2 磁性納米材料富集模型外泌體的質(zhì)譜分析結(jié)果

從鑒定所得蛋白質(zhì)的歸屬情況可以看出上述9種材料均有特異性富集外泌體的能力,即靶向CD63的核酸適配體、MOFs材料中的金屬-氧簇及金屬氧化物均可應(yīng)用于外泌體的分離純化。超速離心法是公認(rèn)的外泌體提取“金方法”,所得外泌體純度高但產(chǎn)量低,離心后的上清液經(jīng)再次離心仍能獲得外泌體,耗時(shí)一般不少于6 h。而使用本文所述的磁性納米材料,只需15 min即可完成分離純化。

在修飾有相同質(zhì)量的CD63適配體情況下,比較同類型雙功能磁性納米材料富集外泌體的差異。含有更多金屬氧化物親和位點(diǎn)的雙功能磁性納米材料可以提高對(duì)外泌體的富集容量,但同時(shí)也會(huì)引入雜蛋白,這歸因于金屬氧化物和適配體結(jié)合外泌體的原理不同。金屬氧化物與外泌體的磷脂雙層膜相互作用,其結(jié)合位點(diǎn)為外泌體的所有膜表面;而CD63適配體的結(jié)合位點(diǎn)僅為外泌體表面眾多膜蛋白中的CD63,即使CD63在外泌體中高表達(dá),其可結(jié)合位點(diǎn)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于金屬氧化物可結(jié)合的位點(diǎn),故引入高含量的金屬氧化物可以提高對(duì)外泌體的富集容量。適配體被認(rèn)為是“化學(xué)抗體”,適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的解離常數(shù)大小通常為μmol～pmol[39],具有高選擇性。同質(zhì)量的雙功能磁性納米材料與基底磁性納米材料相比,修飾的CD63適配體可以大大提高捕獲外泌體的數(shù)量,得到更多的外泌體蛋白,體現(xiàn)了適配體特異性富集外泌體的能力。而僅用基底磁性納米材料富集所得外泌體蛋白數(shù)量均低于雙功能磁性納米材料,表明雙功能材料可以充分結(jié)合核酸適配體親和的高選擇性和金屬氧化物的高富集容量優(yōu)勢,從而用于外泌體的分離純化。

比較不同類型磁性納米材料富集外泌體的差異,3類材料結(jié)合適配體的質(zhì)量均為14.67 μg,而Fe3O4@TiO2類相較于Fe3O4@Zr-MOFs類,質(zhì)量相同但金屬氧化物含量更高,富集所得外泌體蛋白個(gè)數(shù)更多,同時(shí)也引入更多的雜蛋白,再次證明了金屬氧化物的高富集容量優(yōu)勢,后續(xù)需要優(yōu)化材料中適配體的比例以調(diào)節(jié)選擇性。Fe3O4@Zr-MOFs類與Fe3O4@Zr-Ti-MOFs類的富集結(jié)果未見顯著差異,Fe3O4@Zr-Ti-MOFs類金屬氧化物含量更高,且質(zhì)量僅為Fe3O4@Zr-MOFs類1/2,故提高材料金屬氧化物的含量,可以用更少的基底材料結(jié)合同等質(zhì)量的適配體。

結(jié)果表明,Fe3O4@Zr-MOFs-Apt-2、Fe3O4@Zr-Ti-MOFs-Apt-2和Fe3O4@TiO2-Apt-2富集外泌體的性能更優(yōu)異。優(yōu)化金屬氧化物和適配體在雙功能磁性納米材料中的含量與比例,有望進(jìn)一步提高其外泌體富集能力并調(diào)節(jié)其選擇性。在腫瘤液體活檢中,提取到足夠產(chǎn)量和純度的外泌體才能獲得有效的生物信息,所以具有高選擇性和高富集容量的雙功能材料更適用于復(fù)雜樣品中外泌體的分離純化。

2.4 尿液外泌體的富集

經(jīng)過對(duì)磁性納米材料富集外泌體的可行性驗(yàn)證,進(jìn)一步將其應(yīng)用于實(shí)際樣品中外泌體的富集。選取尿液作為實(shí)際樣品,尿液中的干擾成分包括尿調(diào)蛋白等高豐度蛋白以及大小密度與外泌體接近的脂蛋白。用nano LC-MS/MS確認(rèn)9種材料富集所得尿液外泌體蛋白,表3列出質(zhì)譜鑒定到的蛋白個(gè)數(shù)、歸屬于外泌體的蛋白個(gè)數(shù)、非外泌體的蛋白個(gè)數(shù)和游離蛋白的占比,同時(shí)與相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比較。蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息列于表S11～表S19?？梢钥闯?在復(fù)雜樣品中,材料富集所得外泌體蛋白個(gè)數(shù)未見顯著下降,均體現(xiàn)出很好的抗干擾能力。比較同質(zhì)量的雙功能磁性納米材料與基底磁性納米材料富集尿液外泌體的結(jié)果差異,根據(jù)富集組分中非外泌體的蛋白個(gè)數(shù)可以看出,在基底磁性納米材料表面修飾適配體可以增加外泌體蛋白個(gè)數(shù),而少有雜蛋白的引入。如Fe3O4@Zr-MOFs-Apt-2相較于Fe3O4@Zr-MOFs多鑒定出133個(gè)外泌體蛋白,只增加了12個(gè)雜蛋白,證明適配體在復(fù)雜樣品中仍能折疊正確構(gòu)象,保持高選擇性。

表3 磁性納米材料富集尿液外泌體的質(zhì)譜分析結(jié)果

MOFs材料的比表面積大,結(jié)合能力強(qiáng),已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。然而,外泌體由于尺寸限制(30～150 nm)效應(yīng),使其小孔中的作用位點(diǎn)不能夠直接與外泌體產(chǎn)生作用,實(shí)現(xiàn)捕集,也因此MOFs材料結(jié)合外泌體的能力很大程度上取決于金屬氧化物的含量。Fe3O4@Zr-MOFs的金屬元素含量(18.65%(Zr))低于Fe3O4@TiO2(23.65%(Ti)),所以富集的外泌體相對(duì)較少。而通過層層自組裝策略增加MOFs材料中金屬元素的含量,得到的Fe3O4@Zr-Ti-MOFs(25.52%(Zr), 9.65%(Ti))具有較高的金屬氧化物含量,因此也產(chǎn)生了更好的富集效果。

由表3可見,當(dāng)金屬氧化物含量較低時(shí),如Fe3O4@Zr-MOFs-Apt-1、Fe3O4@Zr-Ti-MOFs-Apt-1和Fe3O4@TiO2-Apt-1,鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量均低于相應(yīng)的基底材料(Fe3O4@Zr-MOFs、Fe3O4@Zr-Ti-MOFs和Fe3O4@TiO2),這是由于基底材料的用量更大,即金屬氧化物結(jié)合位點(diǎn)更多,故鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量多。而當(dāng)基底材料用量相當(dāng)時(shí),如Fe3O4@Zr-MOFs-Apt-2、Fe3O4@Zr-Ti-MOFs-Apt-2和Fe3O4@TiO2-Apt-2,雙功能材料鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量顯著高于基底材料。此外,修飾了適配體的雙功能材料富集到的蛋白質(zhì)中游離蛋白所占的比例均低于等量的相應(yīng)基底材料,顯示出適配體的高選擇性。

本課題組還制備了Fe3O4@UiO-66-NH2@PA-Ti4+親水雙金屬磁性納米材料(2 mg, 14.07%(Zr), 6.92%(Ti)),用于尿液外泌體的富集,經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到284個(gè)外泌體蛋白。本文制備的Fe3O4@Zr-Ti-MOFs雙金屬磁性納米材料(2 mg, 25.52%(Zr), 9.65%(Ti)),用于尿液外泌體的富集,經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到319個(gè)外泌體蛋白,兩者富集結(jié)果差異證明提高金屬氧化物含量可以提高對(duì)外泌體的富集容量,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步修飾適配體提高材料選擇性,得到的Fe3O4@Zr-Ti-MOFs-Apt-2(2 mg, 25.52%(Zr), 9.65%(Ti), 14.67 μg CD63適配體)可以富集尿液中343個(gè)外泌體蛋白。

鄧春暉課題組[36]制備了Fe3O4@TiO2-DNA aptamer(5 mg, 12.59%(Ti), 14.72 μg CD63適配體),用于富集尿液外泌體,鑒定得到999個(gè)蛋白質(zhì)。本文采用Fe3O4@TiO2-Apt-2(4 mg, 23.65%(Ti), 14.67 μg CD63適配體)富集尿液外泌體,鑒定得到946個(gè)蛋白質(zhì),歸屬于外泌體的蛋白質(zhì)有832個(gè)。兩者富集結(jié)果未見顯著差異,但在裂解外泌體步驟存在差異:鄧春暉課題組依次用氨水和脫氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)破壞金屬氧化物和適配體與外泌體間的相互作用,將外泌體洗脫后再經(jīng)尿素裂解液裂解。DNase Ⅰ是一種可以消化單鏈寡核苷酸的核酸內(nèi)切酶,CD63適配體經(jīng)DNase Ⅰ水解后,無法恢復(fù)原先的序列及折疊構(gòu)象,失去靶向結(jié)合CD63膜蛋白的能力。而本文使用尿素裂解液在線裂解材料捕集的外泌體,僅破壞CD63-CD63適配體復(fù)合物而不影響適配體在材料表面的固定,同時(shí)又能使外泌體磷脂雙層破裂,釋放外泌體蛋白。

基于金屬氧化物與外泌體磷脂雙層膜和磷酸化肽的磷酸根間的特異性親和作用,該課題組還報(bào)道了將Fe3O4@PDA@UiO-66-NH2應(yīng)用于連續(xù)富集尿液外泌體及外泌體酶解液中的磷酸化肽,鑒定得到來自255個(gè)磷酸化蛋白的707條磷酸化肽[37]。

將雙功能材料富集的尿液外泌體與模型外泌體對(duì)比,均鑒定出模型外泌體(總離子流色譜圖見圖S2)中未鑒定到的外泌體蛋白。如圖2所示,用Fe3O4@Zr-MOFs-Apt-2、Fe3O4@Zr-Ti-MOFs-Apt-2和Fe3O4@TiO2-Apt-2分別富集尿液外泌體,可以對(duì)應(yīng)得到83、125和471個(gè)未在模型外泌體中鑒定到的外泌體蛋白(總離子流色譜圖見圖S3～圖S5),其結(jié)果歸因于親和法與超速離心法提取外泌體的選擇性差異。超速離心法是基于粒徑差異提取外泌體。本文所述雙功能磁性納米材料結(jié)合了適配體親和色譜法和金屬氧化物親和色譜法,靶向外泌體的特征膜蛋白和磷脂雙層膜,材料表面的適配體與金屬氧化物親和基團(tuán)共同作用,排除了脂蛋白等尺寸與外泌體接近的蛋白和細(xì)胞器等的干擾。此外,采用雙功能材料僅需幾十分鐘即可完成復(fù)雜樣品中外泌體捕集,而無需特殊儀器輔助。

圖2 親和法與超速離心法提取外泌體的選擇性差異

3 結(jié)論

本文基于適配體和外泌體表面目標(biāo)膜蛋白的特異性結(jié)合性能與以鈦、鋯為代表的金屬氧化物和外泌體磷脂雙層膜的特異性親和作用,制備了不同類型的金屬/適配體雙功能修飾復(fù)合磁性納米材料,并將其應(yīng)用于外泌體的富集純化。雙功能材料結(jié)合適配體的高選擇性和金屬氧化物的高容量,為新型外泌體富集材料的設(shè)計(jì)提供了新思路。因肝臟釋放的磷酸酶會(huì)將血液中的磷酸化蛋白去磷酸化,故難以識(shí)別血液中磷酸化蛋白的水平,未來可將雙功能材料應(yīng)用于外泌體和外泌體中磷酸化蛋白的連續(xù)富集,促進(jìn)血液外泌體的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究。