尤揚，張曉云

1. 河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003

2. 河南省特色園藝植物開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003

桂花Osmanthus fragrans為木犀科木犀屬常見園林植物，原產(chǎn)中國西南地區(qū)，在秦嶺、淮河以南等地均可露地越冬，河南新鄉(xiāng)為其自然分布的北線［1］。據(jù)南京林業(yè)大學(xué)國際木犀屬品種登錄權(quán)威向其柏教授研究，目前獲得國際品種登錄的桂花共有166 個品種。在這166 個桂花品種中，絕大多數(shù)分布于中國南方地區(qū)，北方地區(qū)由于低溫和鹽堿的影響，分布甚少。萬點金為金桂品種群桂花，主要分布在江浙一帶，為小喬木或叢生大灌木，高達(dá)5～7 m；葉片長橢圓形，基部寬楔形，尖端長漸尖，全緣葉常因葉緣波狀而皺；著花密集呈一個個花球，花深黃色或略呈淺橙黃色，雌蕊完全敗育而不結(jié)實；花期9 月下旬至10 月中旬［2］。

目前對桂花研究多集中于凍害調(diào)查［3］、低溫脅迫下生理生化指標(biāo)的測定［4］、分子生物學(xué)研究［5］和野桂花群落調(diào)查［6］等方面。有關(guān)桂花葉片光學(xué)顯微鏡下的解剖結(jié)構(gòu)偶有報道［7］，而北引桂花模擬外界低溫環(huán)境脅迫處理后葉片超微結(jié)構(gòu)的研究鮮有報道［8］。本研究以從浙江金華引種到河南新鄉(xiāng)栽植的桂花品種萬點金為材料，采用超薄切片法，通過透射電子顯微鏡觀察拍照，研究一系列低溫脅迫下萬點金葉肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，摸清低溫脅迫下葉綠體、線粒體及溶酶體等細(xì)胞器的變化規(guī)律，以期在細(xì)胞學(xué)水平上厘清北引桂花葉肉細(xì)胞中細(xì)胞器的變化規(guī)律，為桂花的合理栽培及耐寒性鑒定提供依據(jù)，也為桂花品種耐寒性篩選提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

HITACHI-HT7700 型透射電子顯微鏡；LEICA EMUC7 切片機(jī)；智能人工氣候室；超凈工作臺；包埋板；磁力攪拌器等。0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液（PBS）；φ=4% 戊二醛；系列體積分?jǐn)?shù)梯度乙醇；φ=1.0 %鋨酸固定液；Epon 812；檸檬酸鉛染色液；醋酸雙氧鈾染色液等。

1.2 供試材料及低溫處理

桂花萬點金O. fragrans‘Wandian Jin’幼苗從浙江金華引種到河南新鄉(xiāng)，3 年生扦插苗，苗高100 cm 左右。引種苗栽于陶質(zhì)盆缽之中，盆高為20 cm，盆口直徑為30 cm，盆內(nèi)土壤養(yǎng)分含量如下： 堿 解 氮 含 量79.6 mg·kg-1， 速 效 磷 含 量28.6 mg·kg-1，速效鉀含量205.2 mg·kg-1，土壤容重1.29 g·cm-3，有機(jī)質(zhì)含量為0.93%。桂花苗木日常土、肥、水、病蟲害等的管理措施同大田生產(chǎn)。

對照及低溫處理：對照材料于25 ℃常溫下取樣，葉片直接用φ=4%戊二醛固定。在低溫脅迫前先把各處理的5 株盆栽萬點金幼苗于10 ℃下預(yù)冷處理48 h；在智能人工氣候室中進(jìn)行模擬低溫處理：溫度依次設(shè)定為5、0 和-5 ℃；光照強(qiáng)度設(shè)置為150 μmol·m-2·s-1，光照時間設(shè)定為12 h；溫度下降速率設(shè)定為每10 min下降1 ℃，當(dāng)溫度降至既定溫度時保持48 h后立即進(jìn)行取樣固定。

1.3 葉片細(xì)胞超薄切片制備

試驗參照李和平［9］的方法進(jìn)行超薄切片的制備，略有改動。每個低溫處理隨機(jī)選取5株萬點金盆栽幼苗的3 個枝條，從該枝條頂端向下數(shù)第3 或4 片葉（健壯、無病蟲害）取樣：在事先預(yù)冷的石蠟面板上和葉片擬取樣部位各滴上一滴預(yù)冷的φ=4%戊二醛溶液，使得取樣部位完全接觸到φ=4%戊二醛溶液；在葉片取樣部位用Leica 刀片避開葉片主脈快速切取1.0 mm×0.5 mm 大小的組織塊，立即用預(yù)冷過的醫(yī)用鑷子謹(jǐn)慎地把材料轉(zhuǎn)移到事先裝有φ=4%預(yù)冷戊二醛溶液的青霉素小瓶中；用醫(yī)用注射器（20 mL）抽氣20 min 左右至絕大多數(shù)組織塊下沉至瓶底部為止，材料置于冰箱上層4 ℃條件下前固定6 h；用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液（PBS，pH 為7.0）沖洗3 次，每次30 min；用鋨酸（φ=1.0%）進(jìn)行后固定6 h；再用同種磷酸緩沖液漂洗3 次，每次30 min；乙醇溶液系列脫水（由于材料較嫩，從較低的體積分?jǐn)?shù)開始）30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%（重復(fù)一次），每個梯度30 min；丙酮過渡；環(huán)氧樹脂Epon812 滲透、包埋；于35、45 和60 ℃下分別聚合12、12、和48 h；用LEICA EMUC7 型超薄切片機(jī)鉆石刀切片；25 ℃下進(jìn)行醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛雙重染色；HITACHI-HT7700 型透射電子顯微鏡下觀察拍照，每個處理取20個觀察視野進(jìn)行研究。

2 實驗結(jié)果

2.1 常溫下萬點金葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

桂花萬點金在常溫（25 ℃）下葉肉細(xì)胞的解剖結(jié)構(gòu)如圖1所示：細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞壁清晰完整（圖1-A，圖1-B）。細(xì)胞核被中央大液泡擠向了細(xì)胞邊緣，核膜完整清晰，電子密度較高的核仁呈不規(guī)則棱柱狀，位于核的近似中央部位（圖1-A，圖1-B）。觀察視野中非導(dǎo)管細(xì)胞葉綠體數(shù)量為1～13個，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，呈餅狀或凸透鏡狀分布于細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)，葉綠體膜清晰可辨，由于尚未形成基粒內(nèi)囊體結(jié)構(gòu)，這種葉綠體為前葉綠體（圖1-B）。葉綠體內(nèi)有少量白色的淀粉粒和電子密度較高的嗜鋨體（圖1-B）。觀察視野中單個細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量為0～4 個。葉肉細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)少許初級溶酶體（圖1-C）：單層膜圍繞的囊狀細(xì)胞器，球形，內(nèi)容物均一；常溫下萬點金葉肉細(xì)胞次級溶酶體的數(shù)量較少。觀察視野中單個細(xì)胞溶酶體的數(shù)量為2～6 個。試驗中發(fā)現(xiàn)了環(huán)紋導(dǎo)管的縱切結(jié)構(gòu)，每隔一定的距離有一木化增厚的次生壁結(jié)構(gòu)加在導(dǎo)管里面的初生壁上（圖1-D）；在導(dǎo)管分子的橫切圖上發(fā)現(xiàn)其側(cè)壁并非完全增厚，未增厚的部分形成了紋孔（pit）（圖1-E，圖1-F）；導(dǎo)管分子在形成過程中，次生壁整體加厚，液泡膜破裂，分解成多個小液泡，細(xì)胞核變形呈不規(guī)則柱狀（圖1-F）。隨著導(dǎo)管分子的進(jìn)一步發(fā)育，其內(nèi)部的一些細(xì)胞器逐步消失，成熟的導(dǎo)管形成一個中空的結(jié)構(gòu)（圖1-E）。

圖1 常溫下萬點金葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of O.fragrans‘Wandian Jin’at normal temperature

2.2 5 ℃處理下萬點金葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

隨著處理溫度的降低，在5 ℃脅迫時萬點金葉肉細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常（圖2-A）。觀察視野中葉綠體數(shù)量為2～13個；部分葉綠體較之常溫時發(fā)生了一定程度的腫脹（圖2-A），而有些葉綠體則并未發(fā)生腫脹現(xiàn)象（圖2-C），這也為低溫過后的恢復(fù)生長提供了光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)；葉綠體基粒片層電子密度較高、垛疊整齊有序、清晰可辨（圖2-C）；5 ℃的低溫處理時，葉綠體內(nèi)嗜鋨體的數(shù)量較常溫時有了一定的增加；葉綠體內(nèi)含的淀粉粒有明暗相間的條紋（圖2-A）。此溫度下，線粒體的數(shù)量也較之常溫有了數(shù)量上的增加，觀察視野中單個細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量為1～6 個，并且聚集在葉綠體周圍（圖2-A）。溶酶體是一種異質(zhì)性的細(xì)胞器，形態(tài)大小都有很大不同［10］。5 ℃低溫脅迫下，觀察視野內(nèi)單個細(xì)胞內(nèi)溶酶體的數(shù)量較常溫時有了明顯增加，觀察視野中單個細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量為3～12個。初級溶酶體結(jié)構(gòu)簡單呈球形，內(nèi)容物均一，沒有明顯的顆粒物（圖2-A，圖2-B，圖2-D）。次級溶酶體結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，形態(tài)不規(guī)則，有的次級溶酶體呈極度不規(guī)則形（圖2-A）；有的則呈圓球形（圖2-B、圖2-E），內(nèi)含顆粒、膜片等；有的呈近似同心圓環(huán)狀（圖2-C）。圖2-C 左下角溶酶體（SL 字母所示，標(biāo)尺為1 μm）為該圖中黑色箭頭所指溶酶體的放大圖，這種近似同心圓環(huán)狀的溶酶體可看作是圖2-E 所示溶酶體的后期狀態(tài)，而圖2-D中溶酶體可以看作是圖2-E中溶酶體的早期狀態(tài)。試驗中還發(fā)現(xiàn)了胞間連絲（圖2-F中黑色箭頭所示）。

圖2 5 ℃處理下萬點金葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Mesophyll cells ultrastructure of O. fragrans‘Wandian Jin’at 5 ℃

2.3 0 ℃處理下萬點金葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

0 ℃低溫脅迫下，萬點金葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞壁層次清晰，質(zhì)膜完整（圖3-A，圖3-B），試驗中發(fā)現(xiàn)了胞間連絲（圖3-A 黑色箭頭所示）。細(xì)胞核核膜清晰，核質(zhì)均勻，電子密度較高的核仁在觀察視野中呈黑色立方體狀（圖3-A）。觀察視野中葉綠體數(shù)量為3～13個；葉綠體腫脹，部分葉綠體呈橢球形（圖3-B，圖3-C），基粒內(nèi)囊體電子密度較高呈黑色，基粒片層垛疊整齊；嗜鋨體較多；淀粉粒有亮暗相間的條紋（圖3-B，圖3-C），并且淀粉粒有腫脹變大的現(xiàn)象（圖3-C）。線粒體數(shù)量較常溫時有增多現(xiàn)象，觀察視野中單個細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量為2～8個，呈圓球形聚集于葉綠體的附近（圖3-A）。0 ℃低溫脅迫時，萬點金葉肉細(xì)胞初級溶酶體、次級溶酶體、殘質(zhì)體共存。初級溶酶體結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)容物均一，呈圓球形（圖3-B）。次級溶酶體結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，大小不一，內(nèi)含多種生物大分子、膜片、顆粒等結(jié)構(gòu)（圖3-C，圖3-D）。近似同心圓環(huán)狀的多泡體聚集在一起構(gòu)成了次級溶酶體（圖3-E），試驗中還發(fā)現(xiàn)有電子密度較高的蛛網(wǎng)狀次級溶酶體（圖3-F）。觀察視野中單個細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量為4～12個。

圖3 0 ℃處理下萬點金葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Mesophyll cells ultrastructure O. fragrans‘Wandian Jin’at 0 ℃

2.4 -5 ℃處理下萬點金葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

桂花萬點金葉肉細(xì)胞在-5 ℃低溫脅迫下細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，層次清晰。細(xì)胞核核膜清晰，核質(zhì)均勻，電子密度較高的核仁位于核的一側(cè)（圖4-A）。觀察視野中葉綠體數(shù)量為4～12個；葉綠體較前期的低溫脅迫腫脹更加劇烈，呈橢球形、半球形，部分葉綠體離開細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)，向細(xì)胞中央游離（圖4-A，圖4-B）；部分葉綠體有縊縮現(xiàn)象（圖4-B）；由于脅迫溫度較低，淀粉粒加劇水解轉(zhuǎn)化為可溶性糖，提高了細(xì)胞滲透勢，從而有利于抵御低溫帶來的傷害，故此，葉綠體中淀粉粒的數(shù)量較之前期低溫處理變得非常少見，只在極個別的葉綠體中發(fā)現(xiàn)了淀粉粒；葉綠體中油體（oil body）的數(shù)量較多，呈球形或橢球形，近圓球形的油體是植物體內(nèi)貯藏形式較為經(jīng)濟(jì)的營養(yǎng)物質(zhì)（圖4-B）。線粒體數(shù)量比常溫時有了一定的增加，這可能是緣于植物對低溫的一種響應(yīng)；線粒體呈球形、橢球形，結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)嵴清晰，聚集在葉綠體周圍，觀察視野中單個細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量為4～10個。-5 ℃低溫脅迫下，初級溶酶體結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)容物均勻，呈圓球形（圖4-C）、新月形（圖4-D）；此溫度下次級溶酶體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，呈球形（圖4-E）、不規(guī)則形（圖4-F）等。觀察視野中單個細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量為4～15個。溶酶體的主要功能是消化作用，在維持細(xì)胞正常代謝活動和防御方面均有著重要作用［10］。

圖4 -5 ℃處理下萬點金葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Mesophyll cells ultrastructure of O. fragrans‘Wandian Jin’at-5 ℃

當(dāng)脅迫溫度降低到-5 ℃時，發(fā)現(xiàn)有桂花萬點金葉肉細(xì)胞有結(jié)冰現(xiàn)象。冰晶的形狀各異，由于透射電鏡照片看到的僅是一個二維剖面圖像，不是三維立體結(jié)構(gòu)，所以就觀察視野看到的而言，有柱狀冰晶、方形冰晶、針狀冰晶、點狀冰晶及不規(guī)則形冰晶。細(xì)胞內(nèi)外均有結(jié)冰的現(xiàn)象：細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰主要在原生質(zhì)或液泡內(nèi)進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰體積相對較小，形態(tài)不一，數(shù)量較多，排列無序，零星散落于液泡內(nèi)（圖5-A，圖5-B）；胞間結(jié)冰冰晶的體積相對較大，冰晶的形狀多樣且無序，冰晶隨機(jī)分布于胞間（圖5-C）。研究中發(fā)現(xiàn)桂花萬點金在-5 ℃低溫脅迫下有質(zhì)膜內(nèi)陷的現(xiàn)象（圖5-C黑色箭頭所示）。

圖5 -5 ℃處理下萬點金葉肉冰晶超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Mesophyll cells ultrastructure of ice crystals in O. fragrans‘Wandian Jin’at-5 ℃

3 討論與小結(jié)

現(xiàn)有研究表明，細(xì)胞器及膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的提高是植物抵御外界低溫脅迫的重要方面［11］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，于-5 ℃低溫脅迫下，桂花萬點金葉肉細(xì)胞有質(zhì)膜內(nèi)陷的現(xiàn)象（圖5-C黑色箭頭所示）。質(zhì)膜內(nèi)陷的生理意義在于增加了細(xì)胞質(zhì)膜的比表面積，擴(kuò)增了細(xì)胞排水總面積，從而便于低溫時細(xì)胞內(nèi)水分快速排出，延緩了細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)冰速度，一定程度上減輕了植物的低溫傷害。從本研究結(jié)果來看，細(xì)胞核在系列低溫脅迫下的穩(wěn)定性較強(qiáng)，沒有發(fā)生明顯的變化。葉綠體則是植物細(xì)胞中對低溫脅迫十分敏感的細(xì)胞器［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)隨著低溫脅迫程度的加劇，葉肉細(xì)胞葉綠體腫脹的現(xiàn)象越來越劇烈，直至-5 ℃低溫處理時，桂花萬點金葉肉細(xì)胞部分葉綠體呈現(xiàn)橢球形、球形，甚至部分葉綠體脫離了細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)，向細(xì)胞中央游離（圖4-A，圖4-B）。逆境脅迫下葉綠體腫脹的現(xiàn)象在多種農(nóng)林作物上均有報道［14-18］。尤揚等［8］研究人工低溫脅迫桂花品種狀元紅時發(fā)現(xiàn)：在5 ℃低溫處理時，葉綠體有輕微膨大現(xiàn)象，0 ℃處理時葉綠體腫脹加劇，-10 ℃處理時，葉綠體降解。有文獻(xiàn)對大花丹桂［19］低溫脅迫下葉肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)：0℃和-5 ℃脅迫時葉綠體膨脹加劇，細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量有增加現(xiàn)象；-10 ℃和-15 ℃處理時，葉肉細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的質(zhì)壁分離，細(xì)胞器崩潰降解。潢川金桂葉肉細(xì)胞葉綠體腫脹的現(xiàn)象在自然降溫條件下也有報道，在過低的溫度下，有細(xì)胞質(zhì)壁分離，甚至有細(xì)胞壁破損的現(xiàn)象［20］。就本文涉及的溫度和桂花狀元紅、大花丹桂和潢川金桂在低溫脅迫下同溫度的超微結(jié)構(gòu)相比較來看，葉綠體的反應(yīng)基本一致。由于本研究并未涉及-10 ℃的低溫脅迫，故此未見桂花萬點金葉肉細(xì)胞葉綠體崩潰解體，也沒有看到質(zhì)壁分離和細(xì)胞壁破裂的現(xiàn)象。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，相對于葉綠體而言，在一定低溫范圍內(nèi)，線粒體于低溫脅迫下是一種比較穩(wěn)定的細(xì)胞器。這也和桂花狀元紅、大花丹桂和潢川金桂葉肉細(xì)胞線粒體在低溫下的反應(yīng)類似，也同時表明相同溫度下，線粒體對低溫的敏感性不及葉綠體。

就本試驗來看，桂花萬點金葉肉細(xì)胞的溶酶體在每個試驗處理中均存在。常溫處理時，溶酶體的數(shù)量較少，觀察視野內(nèi)以初級溶酶體居多，其形態(tài)多呈圓球形，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)容物均一。隨著脅迫溫度的降低（5 ℃、0 ℃、-5 ℃），觀察視野中溶酶體的數(shù)量較之對照的常溫處理有了一定程度增加，初級溶酶體、次級溶酶體和殘質(zhì)體均有發(fā)現(xiàn)。低溫脅迫下溶酶體數(shù)量增加，不僅能及時清除一些無用的衰老的細(xì)胞器、生物大分子等物質(zhì)，作為細(xì)胞內(nèi)的消化“器官”，溶酶體還可為身處低溫逆境下的細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而有利于桂花抵御低溫帶來的傷害。

低溫結(jié)冰對植物造成的傷害有兩種類型，一是細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰傷害，二是細(xì)胞間結(jié)冰傷害。就本試驗研究來看，胞內(nèi)結(jié)冰（圖5-A，圖5-B）和胞間結(jié)冰（圖5-C）兩種類型均有發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰破壞了原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)，致使細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)破壞、酶活動無序、組織分離、代謝紊亂；胞間結(jié)冰造成細(xì)胞間隙冰晶過多時會對原生質(zhì)引發(fā)機(jī)械損傷，當(dāng)溫度回升時，冰晶融化較快，細(xì)胞壁容易恢復(fù)原貌，而原生質(zhì)吸水膨脹要緩慢得多，結(jié)果可能會導(dǎo)致原生質(zhì)被撕裂，繼而對細(xì)胞造成傷害［21］。

總之，一定低溫條件脅迫下桂花萬點金葉肉細(xì)胞葉綠體腫脹變形；淀粉粒減少，部分淀粉粒腫脹變大；線粒體增多；次級溶酶體增多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜；-5 ℃的低溫脅迫下，出現(xiàn)了胞內(nèi)結(jié)冰和胞間結(jié)冰的現(xiàn)象；葉綠體的穩(wěn)定性可以作為桂花抗寒的一個重要參考指標(biāo)。