李濤，孟丹丹，郭水良，袁國徽，錢振官，呂衛(wèi)光*

1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，上海 201403；2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234

被稱為“生態(tài)系統(tǒng)工程師”的蚯蚓，是土壤系統(tǒng)的重要組成部分（Ojha et al.，2014），在改良土壤、消解農(nóng)業(yè)廢棄物、提高土壤養(yǎng)分和作物產(chǎn)量方面發(fā)揮著重要的作用（吳娜娜等，2015；Manono，2016）。蚯蚓是土壤大型無脊椎動(dòng)物的代表，其生物量約占土壤動(dòng)物生物量的 60%—80%（Jouquet et al.，2010）。蚯蚓數(shù)量被認(rèn)為是土壤健康和衡量農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效指標(biāo)（Blouin et al.，2013；郭佳惠等，2016）。以農(nóng)用化學(xué)品高投入為特點(diǎn)的現(xiàn)代集約農(nóng)業(yè)在過去幾十年中取得了巨大的成功，但是農(nóng)藥化肥的大量使用也對生態(tài)環(huán)境造成了污染（Hackenberger et al.，2018）。農(nóng)藥是土壤污染物的重要來源（付青等，2019；譚華東等，2021），土壤中的蚯蚓可通過皮膚直接接觸或取食土壤中受污染的食物而接觸農(nóng)藥，從而引起蚯蚓死亡或影響其生長（Wang et al.，2000）。蚯蚓對土壤中的污染物較為敏感，是開展土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估的重要指示生物（宋雪英等，2016；張慧琦等，2017）。

中國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，農(nóng)藥作為重要的生產(chǎn)資料，在防治有害生物，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全方面發(fā)揮了重要的作用，但是長期大量使用農(nóng)藥也給中國生態(tài)環(huán)境造成了一定的負(fù)面影響（蒲生彥等，2019）。中國農(nóng)藥管理部門越來越重視農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的安全評價(jià)，但是大部分的研究主要著眼于農(nóng)藥對鳥類、魚類和蜜蜂的負(fù)面影響，有關(guān)農(nóng)藥對蚯蚓等土壤動(dòng)物的影響還未受到足夠的重視（姜錦林等，2014）。近年來，關(guān)于農(nóng)藥對蚯蚓毒性的研究在國內(nèi)外已有一些報(bào)道，但所涉及的品種主要為殺蟲劑和殺菌劑（陳愛梅等，2013；林濤等，2015）。使用的化學(xué)農(nóng)藥中，除草劑占比最大，發(fā)達(dá)國家除草劑用量占市場上所有農(nóng)藥用量的 70%以上，并在未來有進(jìn)一步上升的趨勢（Muthukaruppan et al.，2005）。截至目前，有關(guān)除草劑對蚯蚓毒性的研究較少，生產(chǎn)中常用除草劑對蚯蚓毒性還不明確。王彥華等（2012）研究了22種除草劑對蚯蚓的急性毒性，其中的特丁津、莎稗磷、乙草胺、丙草胺和精異丙甲草胺采用濾紙接觸法測定時(shí)對蚯蚓表現(xiàn)為中等毒性。林濤等（2015）采用藥土法測定了2, 4-D二甲胺鹽對蚯蚓的急性毒性，表現(xiàn)為低毒。在已發(fā)表的有關(guān)除草劑對蚯蚓急性毒性的文獻(xiàn)資料中，大部分供試除草劑都是一些較老的品種，在當(dāng)前的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已不常用，部分品種甚至已經(jīng)被禁用如甲磺隆和百草枯等。因此，本研究的目標(biāo)是：測定當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的 17種除草劑對蚯蚓的急性毒性，明確除草劑對蚯蚓的劑量-毒性效應(yīng)關(guān)系，為評估除草劑對蚯蚓的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供數(shù)據(jù)信息，同時(shí)為安全、科學(xué)使用除草劑提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試除草劑

選擇當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的 17種除草劑開展試驗(yàn)，供試除草劑原藥如下：90%二氯喹啉酸（quinclorac），江蘇省激素研究所股份有限公司生產(chǎn)；96%滅草松（bentazone），安徽豐樂農(nóng)化有限責(zé)任公司生產(chǎn)；95% 2甲4氯鈉（MCPA-Na），江蘇健谷化工有限公司生產(chǎn)；96%噁唑酰草胺（metamifop），安徽眾邦生物工程有限公司生產(chǎn)；95%雙草醚（bispyribac-sodium）、98%吡嘧磺隆（pyrazosulfuron-ethyl），江蘇瑞邦農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；98%五氟磺草胺（penoxsulam），美國陶氏益農(nóng)公司生產(chǎn)；95%嘧啶肟草醚（pyribenzoxim），安徽圣豐生化有限公司生產(chǎn)；97%氰氟草酯（cyhalofop-butyl），江蘇中旗科技股份有限公司生產(chǎn)；98%丙草胺（pretilachlor），山東濱農(nóng)科技有限公司生產(chǎn)；95%草銨膦（glufosinate ammonium），利爾化學(xué)股份有限公司生產(chǎn)；97%高效氟吡甲禾靈（haloxyfop-R-methyl）、95%乙羧氟草醚（fluoroglycofen），江蘇長青農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；96%二甲戊靈（pendimethalin），山東天成生物科技有限公司生產(chǎn)；97%苯唑草酮（topramezone），巴斯夫歐洲公司生產(chǎn)；97%硝磺草酮（mesotrione），江蘇豐山集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；95%煙嘧磺?。╪icosulfuron），江蘇龍燈化學(xué)有限公司生產(chǎn)。所有供試除草劑原藥均從市場購買獲得。

1.2 供試蚯蚓

供試蚯蚓為赤子愛勝蚓（Eisenia fetida），由上海瀛西果蔬專業(yè)合作社提供。試驗(yàn)開始前先在室內(nèi)裝有土的周轉(zhuǎn)箱中預(yù)養(yǎng)15 d（20—25 ℃，相對濕度60%—70%）。挑選大小一致且環(huán)帶明顯的健康蚯蚓開展試驗(yàn)，蚯蚓個(gè)體質(zhì)量400—500 mg。按照Fründ et al.（2010）推薦的方法檢查蚯蚓的健康狀態(tài)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 濾紙接觸法

參照歐洲共同體推薦的濾紙接觸法（OECD，1984），并略做改進(jìn)（用培養(yǎng)皿代替了平底玻璃管），開展試驗(yàn)。在直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，內(nèi)置一層相同直徑大小的濾紙。每個(gè)培養(yǎng)皿添加2 mL用丙酮溶解配制的藥液，并放置在通風(fēng)櫥中24 h，待丙酮完全揮發(fā)后加入2 mL蒸餾水潤濕濾紙，同時(shí)加入1條蚯蚓。蚯蚓加入前先被置于濕潤的濾紙上清腸24 h（20 ℃，全黑），以排空其腸道內(nèi)容物。將添加了藥液和蚯蚓的培養(yǎng)皿置于20 ℃，相對濕度75%的人工氣候箱（MLR-352H，Sanyo Electric Co.，Ltd.，Osaka，Japan）中黑暗培養(yǎng)，分別于24 h和48 h調(diào)查并記錄蚯蚓死亡數(shù)，以蚯蚓前尾部對機(jī)械刺激無反應(yīng)視為死亡。死亡率按照下式計(jì)算：

式中：

P為死亡率；

Pt為處理組死亡率；

C為對照組死亡率。當(dāng)對照組死亡率低于10%時(shí)為有效測定數(shù)據(jù)。

正式試驗(yàn)之前，先進(jìn)行了選擇藥劑有效濃度范圍的預(yù)試驗(yàn)，求出每個(gè)供試藥劑對蚯蚓全致死的最低濃度和全存活的最高濃度，并在此范圍內(nèi)設(shè)置正式試驗(yàn)的濃度。每個(gè)藥劑設(shè)置5個(gè)濃度，以添加丙酮的處理為對照。10條蚯蚓為一組，并視為1次重復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 人工土壤法

參照歐洲共同體推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法配制人工土壤（Oecd，1984）。人工土壤由10%泥炭蘚、20%高嶺土、69%石英砂和 1%碳酸鈣組成。將供試除草劑原藥用丙酮溶解后拌于10 g石英砂中，待丙酮完全揮發(fā)后與490 g人工土壤充分混勻，加入蒸餾水調(diào)節(jié)人工土壤含水量至35%。將含有藥劑的人工土壤裝入1250 mL的黑色帶蓋塑料盒中，每個(gè)塑料盒添加10條預(yù)先在人工土壤中馴養(yǎng)并清腸24 h的蚯蚓。塑料盒蓋上鉆有通氣孔，便于氣體交換。塑料盒置于20 ℃，相對濕度75%的人工氣候箱中光照黑暗各12 h培養(yǎng)（光照強(qiáng)度400—800 lx）。分別于7 d和14 d調(diào)查蚯蚓死亡數(shù)，計(jì)算死亡率。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)和死亡率計(jì)算公式同濾紙接觸法。

正式試驗(yàn)之前，先進(jìn)行了選擇濃度范圍的預(yù)試驗(yàn)，通過設(shè)置 0.1、1、10、100、1000 mg·kg?15個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以確定導(dǎo)致蚯蚓 0—100%死亡率的濃度范圍。并根據(jù)確定的濃度范圍，每個(gè)藥劑設(shè)置5—7個(gè)供試濃度，每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)，以添加丙酮的人工土壤為對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用DPS 7.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，以供試除草劑濃度的對數(shù)值和蚯蚓死亡率的幾率值進(jìn)行回歸分析，計(jì)算半數(shù)致死濃度（median lethal concentration，LC50）、95%置信限和相關(guān)系數(shù)r。濾紙接觸法測定的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)為（Roberts et al.，1984）：LC50≤1.0 μg·cm?2，劇毒；1.0 μg·cm?21000.0 μg·cm?2，微毒。人工土壤法測定的毒性分級采用 GB/T 31270.15—2014化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第15部分：蚯蚓急性毒性試驗(yàn)（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2014）中提出的標(biāo)準(zhǔn)：LC50≤0.1 mg·kg?1，劇毒；0.110.0 mg·kg?1，低毒。

2 結(jié)果與分析

采用濾紙接觸法和人工土壤法開展試驗(yàn)期間，丙酮對照組的蚯蚓生長正常，未見死亡，表明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)合理有效。

2.1 濾紙接觸法測定結(jié)果

濾紙接觸法測定結(jié)果見表 1。研究表明，除草劑對赤子愛勝蚓的毒性與除草劑品種及染毒時(shí)間有關(guān)。赤子愛勝蚓與除草劑接觸后，部分處理的蚯蚓出現(xiàn)身體卷曲（圖1a、b）、體節(jié)腫大充血（圖1c、d）、身體斷裂糜爛等癥狀（圖1e、f）。濾紙接觸法染毒24 h調(diào)查，噁唑酰草胺對赤子愛勝蚓的毒性最高，LC50為 9.9 μg·cm?2，屬高毒級；其次為丙草胺、高效氟吡甲禾靈、滅草松，LC50分別為 14.8、33.3、73.4 μg·cm?2，屬中毒級；再次為二氯喹啉酸、2甲4氯鈉、苯唑草酮、雙草醚，LC50分別為 161.8、252.4、266.4、908.3 μg·cm?2，屬低毒級；煙嘧磺隆、草銨膦、二甲戊靈、乙羧氟草醚、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮、嘧啶肟草醚對赤子愛勝蚓的 LC50均大于1000.0 μg·cm?2，屬微毒級。隨著染毒時(shí)間的延長，供試除草劑對赤子愛勝蚓的毒性有所增加。濾紙接觸法染毒48 h調(diào)查，噁唑酰草胺對赤子愛勝蚓的毒性依然最高，LC50為 7.6 μg·cm?2，屬高毒級；其次為丙草胺、高效氟吡甲禾靈、滅草松，LC50分別為 10.7、12.7、61.3 μg·cm?2，屬中毒級；再次為二氯喹啉酸、2甲4氯鈉、苯唑草酮、草銨膦、雙草醚，LC50分別為143.0、198.2、211.1、466.9、649.2 μg·cm?2，屬低毒級；二甲戊靈、乙羧氟草醚、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮、嘧啶肟草醚對赤子愛勝蚓的 LC50均大于 1000.0 μg·cm?2，屬微毒級。

圖1 除草劑對赤子愛勝蚓的形態(tài)異常特征Fig. 1 Morphological abnormalities of the herbicides on Eleusine fetida

表1 采用濾紙接觸法測定的除草劑對赤子愛勝蚓的急性毒性Table 1 Acute toxicity of herbicides to Eisenia fetida by using filter paper contact test

2.2 人工土壤法測定結(jié)果

人工土壤法測定結(jié)果見表 2。與濾紙接觸法測定的結(jié)果類似，采用人工土壤法測定時(shí)，不同除草劑對赤子愛勝蚓的毒性同樣與除草劑品種及染毒時(shí)間有關(guān)。人工土壤法染毒7 d調(diào)查，高效氟吡甲禾靈對赤子愛勝蚓的毒性最高，LC50為181.6 mg·kg?1；其次為 2甲 4氯鈉、丙草胺、二甲戊靈、煙嘧磺隆，LC50分別為 340.3、423.1、480.3、754.5 mg·kg?1；二氯喹啉酸、滅草松、噁唑酰草胺、雙草醚、乙羧氟草醚、苯唑草酮、草銨膦、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮和嘧啶肟草醚對赤子愛勝蚓的毒性相對較低，LC50均大于 800.0 mg·kg?1。隨著染毒時(shí)間的延長，供試除草劑對赤子愛勝蚓的毒性有所增加。人工土壤法染毒14 d調(diào)查，高效氟吡甲禾靈對赤子愛勝蚓的毒性依然最高，LC50為 148.9 mg·kg?1；其次為丙草胺、2甲 4氯鈉、二甲戊靈、噁唑酰草胺、苯唑草酮、滅草松、煙嘧磺隆、二氯喹啉酸和嘧啶肟草醚，LC50分別為 211.5、335.0、342.4、345.7、573.3、649.5、703.1、715.0、743.6 mg·kg?1；雙草醚、乙羧氟草醚、草銨膦、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺和硝磺草酮對赤子愛勝蚓的毒性相對較低，LC50均大于 800.0 mg·kg?1。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中的分級標(biāo)準(zhǔn)，采用人工土壤法測定的 17種除草劑對赤子愛勝蚓的毒性等級均為低毒級。

表2 采用人工土壤法測定的除草劑對赤子愛勝蚓的急性毒性Table 2 Acute toxicity of herbicides to Eisenia fetida by using artificial soil test

3 討論

急性毒性試驗(yàn)對評估化學(xué)品對蚯蚓的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要的作用。據(jù)Heimbach（1992）報(bào)道，急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果與實(shí)際觀察到的影響之間具有較好的相關(guān)性。開展除草劑對蚯蚓的急性毒性試驗(yàn)，可以快速對除草劑的毒性做出初步的判斷。測定蚯蚓急性毒性的方法很多，例如濾紙接觸法、人工土壤法、飼喂法、注射法、浸入法、點(diǎn)滴法、強(qiáng)迫攝食法和自然土壤法（Wang et al.，2012a），其中濾紙接觸法和人工土壤法受到的關(guān)注最多，并被OECD列為開展化學(xué)品對蚯蚓急性毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法（OECD，1984）。濾紙接觸法易操作、速度快、可重復(fù)性好，反映了除草劑對蚯蚓的經(jīng)皮毒性，常作為預(yù)試驗(yàn)或應(yīng)急預(yù)警的試驗(yàn)方法（Tripathi et al.，2010）。人工土壤法模擬了蚯蚓生活的自然環(huán)境，測定結(jié)果較客觀，反映了除草劑被蚯蚓腸道吸收后的毒性（Udovic et al.，2010）。本研究同時(shí)采用濾紙接觸法和人工土壤法開展試驗(yàn)，可以更全面地了解供試除草劑對蚯蚓的毒性。

除草劑是全世界使用量最大的農(nóng)藥類別，蚯蚓死亡率與除草劑使用之間的關(guān)系仍不明確。以往的研究表明，有些除草劑對蚯蚓有直接毒性，而有些除草劑則沒有影響（Zarea et al.，2012）?，F(xiàn)代除草劑的創(chuàng)制朝著高效、低毒的方向發(fā)展，除草劑對蚯蚓的毒性一般較低，但也有一些例外。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論，本次測定，不同除草劑之間對蚯蚓的毒性差異較大。采用濾紙接觸法測定，噁唑酰草胺對赤子愛勝蚓屬高毒級；丙草胺、高效氟吡甲禾靈和滅草松對赤子愛勝蚓屬中毒級；二氯喹啉酸、2甲 4氯鈉、苯唑草酮、草銨膦、煙嘧磺隆和雙草醚對赤子愛勝蚓屬低毒級；吡嘧磺隆、五氟磺草胺、嘧啶肟草醚、氰氟草酯、乙羧氟草醚、二甲戊靈和硝磺草酮屬微毒級。采用人工土壤法測定，高效氟吡甲禾靈對赤子愛勝蚓毒性最高；其次為丙草胺、2甲 4氯鈉、二甲戊靈和噁唑酰草胺；人工土壤法測定的17種除草劑對赤子愛勝蚓均為低毒級。王彥華等（2012）采用濾紙接觸法和人工土壤法測定了草銨膦、丙草胺、氰氟草酯對赤子愛勝蚓的急性毒性，測定結(jié)果與本研究一致。

除草劑對蚯蚓的毒性結(jié)果與測定方法的選擇有關(guān)。濾紙接觸法中，除草劑黏附在濾紙表面，蚯蚓通過體表直接接觸藥劑，對藥劑的吸收量大，吸收速率快。人工土壤法中，藥劑被土壤膠體和有機(jī)質(zhì)吸附，受環(huán)境的影響，還會發(fā)生降解，從而降低了蚯蚓對藥劑的吸收（Saxena et al.，2014）。本研究同時(shí)采用濾紙接觸法和人工土壤法測定除草劑對赤子愛勝蚓的毒性，結(jié)果雖然略有不同，但整體趨勢一致。無論是采用濾紙接觸法還是人工土壤法，噁唑酰草胺、高效氟吡甲禾靈、丙草胺、滅草松和2甲4氯鈉對赤子愛勝蚓均表現(xiàn)出相對較高的毒性。Wang et al.（2012b）研究表明，不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥對蚯蚓的毒性差異較大。本次測定，濾紙接觸法中毒性最高的噁唑酰草胺和人工土壤法中毒性最高的高效氟吡甲禾靈，從化學(xué)結(jié)構(gòu)看都屬于芳氧苯氧基丙酸酯類除草劑，該類除草劑可能對蚯蚓具有相對較高的毒性。

近年來，在上海都市農(nóng)業(yè)中，種植戶為了增加土壤中蚯蚓的數(shù)量，開始實(shí)施和推廣往農(nóng)田接種蚯蚓的作法，接種蚯蚓后的農(nóng)田，如何安全使用除草劑，是種植戶最關(guān)心的問題之一。本研究可為接種蚯蚓的農(nóng)田安全使用除草劑提供技術(shù)指導(dǎo)。本研究僅測定了除草劑對蚯蚓的急性毒性效應(yīng)。事實(shí)上，在自然的土壤環(huán)境中常存在多種除草劑長期低劑量暴露，其對蚯蚓的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)不容忽視（王飛菲等，2014）。下一步需要更多地研究多種除草劑聯(lián)合暴露對蚯蚓的毒性效應(yīng)，以便進(jìn)行充分的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估。

4 結(jié)論

除草劑是全世界使用量最大的農(nóng)藥類別，開展除草劑對蚯蚓的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估意義重大。本研究測定的 17種除草劑，大部分對蚯蚓的毒性較低，但不同除草劑之間差異較大。采用濾紙接觸法試驗(yàn)，噁唑酰草胺對赤子愛勝蚓屬高毒級；丙草胺、高效氟吡甲禾靈和滅草松屬中毒級；二氯喹啉酸、2甲 4氯鈉、苯唑草酮、草銨膦、煙嘧磺隆和雙草醚屬低毒級；吡嘧磺隆、五氟磺草胺、嘧啶肟草醚、氰氟草酯、乙羧氟草醚、二甲戊靈和硝磺草酮屬微毒級。采用人工土壤法試驗(yàn)，高效氟吡甲禾靈對赤子愛勝蚓的急性毒性最高；其次為丙草胺、2甲 4氯鈉、二甲戊靈、噁唑酰草胺、苯唑草酮和滅草松。采用人工土壤法測定的17種除草劑對赤子愛勝蚓均為低毒級。本研究可為評估除草劑對蚯蚓的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供新的數(shù)據(jù)信息，同時(shí)可為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中安全使用除草劑提供技術(shù)指導(dǎo)。