殷 燕，張 曄，吳新然，霍孟可，蔣麗珠,

(1. 云南省第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650011；2. 大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671005)

阿爾茨海默病的發(fā)生與大腦萎縮性改變有關(guān)，這種改變會(huì)導(dǎo)致記憶缺失、認(rèn)知功能障礙和突觸損傷[1]。衰老、晝夜節(jié)律紊亂、Aβ積累和tau蛋白過度磷酸化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、興奮毒性等都能促進(jìn)阿爾茨海默病的發(fā)展[2-4]，目前還沒有確切阻止阿爾茨海默病進(jìn)展的治療方法。益智仁補(bǔ)脾補(bǔ)腎、固澀，具有益智健腦、強(qiáng)心、抗癌、抗衰老、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，且益智仁的不同化學(xué)成分對神經(jīng)細(xì)胞有一定保護(hù)作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)建立阿爾茨海默病炎癥模型，從細(xì)胞、分子水平觀察益智仁含藥血清對LPS致小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)損傷的保護(hù)作用，以研究益智仁在阿爾茨海默病防治中的可能作用機(jī)制，為臨床更好地防治阿爾茨海默病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 健康SD大鼠20只，體重(230±20)g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(0012158)，飼養(yǎng)于清潔級動(dòng)物室。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫22～25 ℃，濕度50%～70%，灌胃過程中動(dòng)物自由攝食和飲水。BV2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.2藥物及主要試劑 益智仁藥材成品顆粒購自三九藥業(yè)有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，SH30243.01B)；雙抗(鏈霉素100 IU/mL 和青霉素100 IU/mL)、0.25%胰酶(millipore，SM-2003-C)；胎牛血清(Hyclone，SH30070.03)；MTT(美國 MP Biomedicals， Q2644)；DMSO(sigma， D2650-5X5ML)；腫瘤壞死因子-α (TNF-α)抗體(CST，11948S)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)抗體(CST，83186S)；NF-κBp65抗體(CST，8242S)；Nitrate/Nitrite Assay Kit(碧云天，S0023)；Goat anti mouse IgG、Rabbit IgG antibody購自Gene Tex公司。

1.3細(xì)胞的體外培養(yǎng)與傳代 BV2細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃條件下5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次。細(xì)胞融合至80%左右，吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次，輕輕加入1 mL 0.25%胰酶消化液，消化1～2 min，待細(xì)胞變圓開始脫落時(shí)，立即加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化并反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液，于1 000 r/min離心(離心半徑7 cm)3 min，小心棄去上清液后，加入DMEM高糖完全培養(yǎng)液，輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4含藥血清的制備 取健康雌性SD大鼠20只，隨機(jī)分為對照組和益智仁低、中、高劑量組，每組5只。益智仁低、中、高劑量組分別給予5 g/(kg·d)、10 g/(kg·d)、20 g/(kg·d)益智仁藥粉灌胃，對照組給予等體積生理鹽水灌胃，灌胃量均為10 mL/kg，連續(xù)7 d。末次灌胃(禁食12 h不禁水)后 2 h，戊巴比妥腹腔注射麻醉后無菌條件下腹主動(dòng)脈采血，4 ℃ 3 000 r/min 離心(離心半徑7 cm)15 min，分離上層血清，置于56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5MTT法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的BV2細(xì)胞，消化、離心后用完全培養(yǎng)液重懸制成濃度為1×104個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，接種于96孔板內(nèi)，每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液。然后將細(xì)胞分為正常對照組、模型組、對照血清組及益智仁含藥血清低、中、高劑量組。正常對照組只加細(xì)胞懸液，不給予任何處理；模型組加入LPS使其終濃度為50 μg/mL；對照血清組及益智仁含藥血清低、中、 高劑量組分別加入應(yīng)的血清使每孔細(xì)胞含10%的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)預(yù)處理2 h后，各組每孔細(xì)胞再加入LPS使其終濃度為50 μg/mL。每組細(xì)胞分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT溶液10 μL，使其終濃度為0.5 mg/mL，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。棄掉孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩儀振蕩15 min，至紫色晶體顆粒充分溶解后，于波長490 nm處測定吸光度，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白對照孔值)/(對照組吸光度值-空白對照空值)×100%。

1.6Griess法測定細(xì)胞上清液中一氧化氮(NO)水平 根據(jù)NO在水溶液中生成的亞硝酸鹽(NO2-)與Griess試劑反應(yīng)，可測得細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO2-，間接評定NO水平。將BV2細(xì)胞懸液接種在12孔板中，按照1.5中分組處理，培養(yǎng)24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心。離心后將不同組別的50 μL細(xì)胞上清液分別加入96孔板中，再依次加入GriessⅠ 50 μL、GRessⅡ 50 μL，混勻后在540 nm波長下檢測吸光度值，根據(jù)試劑盒提供的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測算出對應(yīng)的NO值。

1.7免疫熒光檢測NF-κBp65表達(dá)情況 將細(xì)胞懸液接種在鋪有細(xì)胞爬片的12孔板中，待細(xì)胞貼壁后按照1.5中方法分組處理，培養(yǎng)24 h后棄上清。12孔板中的貼壁細(xì)胞用0.01 mol/LPBS潤洗3遍，每次5 min。每孔中加入500 μL預(yù)冷的4%多聚甲醛固定2 h。固定后用PBS潤洗后用5%BSA封閉1 h后加入一抗NF-κBp65(兔抗1∶1 000)4 ℃孵育過夜，再用PBS潤洗3遍。加入對應(yīng)的二抗(M488綠色1∶500+RCy3紅色1500+DAPI 11000)室溫孵育2 h后，用0.01 mol/LPBS潤洗。最后用抗熒光猝滅劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.8Western blotting檢測TNF-α、IL-1β、NF-κBp65蛋白表達(dá)情況 將細(xì)胞懸液接種在6孔板中，按照1.5中方法分組處理，培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA-100 蛋白質(zhì)定量測定試劑盒測定樣品總蛋白含量。各組取40 μg蛋白上樣，用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)；電泳結(jié)束后用電轉(zhuǎn)印儀將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，5%BSA封閉2 h，加入一抗TNF-α(兔抗1∶500)、IL-1β(兔抗1∶300)、NF-κBp65(兔抗1∶500)4 ℃孵育過夜，TBST液洗膜10 min×3次后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST液洗膜后用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶，照相保存，用Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞存活率比較 模型組BV2細(xì)胞的OD值和細(xì)胞存活率均明顯低于正常對照組(P均<0.05)；益智仁含藥血清各組細(xì)胞的OD值和細(xì)胞存活率均較模型組高，其中益智仁含藥血清高劑量組明顯高于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組BV2細(xì)胞存活率比較

2.2各組細(xì)胞上清液中NO水平比較 正常對照組、模型組、對照血清組及益智仁含藥血清高、中、低劑量組上清液中NO水平分別為(0.388±0.081)μmol/L、(0.682±0.142)μmol/L、(0.626±0.104)μmol/L、(0.412±0.048)μmol/L、(0.600±0.088)μmol/L、(0.564±0.105)μmol/L，模型組NO水平明顯高于正常對照組(P<0.05)，益智仁含藥血清各組NO水平均較模型組低，其中益智仁含藥血清高劑量組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3各組免疫熒光檢測NF-κBp65表達(dá)情況 正常對照組細(xì)胞中NF-κBp65主要在胞質(zhì)表達(dá)，核內(nèi)幾乎看不到其熒光表達(dá)；模型組細(xì)胞中NF-κBp65被激活，NF-κBp65從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)；益智仁含藥血清各組細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)較少。見圖1。

圖1 免疫熒光下各組BV2細(xì)胞中NF-κBp65核轉(zhuǎn)移情況(×200)

2.4各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、NF-κBp65蛋白表達(dá)情況比較 模型組BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、NF-κBp65蛋白表達(dá)量均明顯高于正常對照組(P均<0.05)；益智仁含藥血清各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、NF-κBp65蛋白表達(dá)量均較模型組低，其中益智仁含藥血清中、高劑量組均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖2及表2。

1為正常對照組；2為模型組；3為對照血清組； 4為益智仁含藥血清低劑量組；5為益智仁含藥血清中劑量組；6為益智仁含藥血清高劑量組

表2 各組BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、NF-κBp65蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

益智仁是姜科山姜屬多年生植物益智(AlpiniaoxyphyllaMiq)的干燥成熟果實(shí)，又名益智子、摘芋子、大帝子，主要生長在我國廣西、廣東、海南等地，其性溫，味辛，歸脾、腎經(jīng)，可暖腎固精、縮小便、溫脾止瀉、攝唾涎[4]。目前對于益智仁藥理作用的研究主要在于其益智健腦、神經(jīng)保護(hù)作用，其次是抗癌、強(qiáng)心、舒張血管、提高免疫力、抗氧化等作用[8-10]。

阿爾茨海默病是一種復(fù)雜的、漸進(jìn)的、不可逆的神經(jīng)退行性疾病，神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與其發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[11]。神經(jīng)炎癥主要由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)，小膠質(zhì)細(xì)胞作為主要的免疫細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道防線，具有促進(jìn)宿主防御和修復(fù)及神經(jīng)毒性雙重作用[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活后，可以通過釋放大量的NO、TNF-α、IL-1β和活性氧產(chǎn)物等細(xì)胞因子，引發(fā)周圍神經(jīng)元壞死和凋亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)損傷，特別是加重神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展[13]。神經(jīng)炎癥的病理過程與炎癥因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)，NF-κB在其中起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[14]。NF-κB主要是由P65和P50蛋白亞基組成的同源或異源二聚體。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB與抑制蛋白IKB結(jié)合，以非活性狀態(tài)形式存在于細(xì)胞漿中；外界致炎物質(zhì)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后，在蛋白激酶作用下，IKB與NF-κB解離，IKB磷酸化，被蛋白酶小體降解，將NF-κB釋放出來變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，炎癥基因的表達(dá)正是受NF-κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14-15]。IL-1β是重要的免疫反應(yīng)啟動(dòng)劑，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生IL-1β，IL-1β從胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，通過NF-κB途徑上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)其產(chǎn)生更多的促炎因子，作用于其他細(xì)胞從而發(fā)揮作用[16-17]。IL-1β在阿爾茨海默病患者腦內(nèi)表達(dá)增高，可誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺積累，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Aβ沉積和SP形成[16-18]；IL-1β還可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的一氧化氮合成酶活性增加而產(chǎn)生大量NO，在阿爾茨海默病的神經(jīng)變性過程中發(fā)揮作用[19]。有研究表明，減少或抑制IL-1β釋放對阿爾茨海默病的病程有一定抑制作用[20]。

本實(shí)驗(yàn)中MTT結(jié)果顯示，益智仁含藥血清本身對細(xì)胞無毒性作用，高劑量的益智仁含藥血清對LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，可以減少細(xì)胞死亡，提高細(xì)胞存活率；在LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)NO、TNF-α、IL-1β和NF-κBp65表達(dá)水平明顯升高，而高劑量益智仁含藥血清干預(yù)后，以上炎癥因子的表達(dá)水平明顯降低，說明益智仁含藥血清可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而減少炎癥因子的產(chǎn)生。推測益智仁含藥血清抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性細(xì)胞因子分泌增加的分子機(jī)制可能與NF-κB炎癥信號通路有關(guān)，但其確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討，以期為神經(jīng)退行性疾病的臨床防治提供一定依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。