劉瑤萍，張 曾，范朝華，王文健，楊宏杰，何燕銘

(1. 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,上海 200437；2. 上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結合臨床研究所，上海 200083)

糖尿病腎病是2型糖尿病危害最重的并發(fā)癥之一，與血糖、血脂控制欠佳，吸煙，氧化應激，糖基化終末產物的積累，環(huán)境和遺傳等因素密切相關。胰島素抵抗在2型糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)病機制中起關鍵作用。中醫(yī)認為胰島素抵抗的病機是氣聚不化，濕熱內蘊，血瘀阻滯，屬“聚證”范疇，益氣化聚方則是基于治療 “聚證”的思想創(chuàng)制而成[1]。方中黃芪甘溫，補中益氣，提升脾氣以推動樞機，促進氣化以利游溢、布散精氣；蒲黃散積聚，化瘀血；黃連清熱、瀉火、燥濕，去濕熱之邪；茵陳清濕邪，解熱滯。諸藥合用，使氣化恢復，痰濁、濕熱、瘀血消散，精微物質能夠正?；?、布散。臨床研究發(fā)現，該方可有效改善肥胖、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝等疾病[2-4]。在此基礎上，課題組在益氣化聚湯中藥配伍中加入溫腎清利消積中藥附子、六月雪、積雪草，組成了化聚消積方，其中附子辛甘熱，歸腎經，溫陽補腎；六月雪、積雪草清熱利濕。臨床及動物實驗證實化聚消積方可減少2型糖尿病腎病的尿微量白蛋白[5-6]。本研究借助網絡藥理學方法挖掘化聚消積方的主要活性成分及可能的作用靶點，探討化聚消積方干預糖尿病腎病可能的作用機制，為臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1化聚消積方成分及靶點篩選 化聚消積方由黃芪30 g、黃連10 g、蒲黃15 g、茵陳15 g、積雪草15 g、六月雪15 g、附子9 g構成。利用TCMSP平臺(http://tcmspw.com/index.php)和BATMAN數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)完成化聚消積方中5個中藥有效成分搜索，再根據所有化合物的口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)進行篩選，篩選標準來自TCMSP的推薦值OB≥30%；DL≥0.18。經篩選后的化合物，顯示其對應的靶點備用。

1.2糖尿病腎病疾病靶點篩選 利用GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)和OMIM數據庫(https://omim.org/)來獲取糖尿病腎病的靶點。運用主題詞Diabetic Nephropathy(主題詞來自MeSH)進行搜索。

1.3構建蛋白相互作用網絡 將化聚消積方的靶點與糖尿病腎病靶點取交集后，結果輸入STRING數據庫，選擇人源性靶點，得到關于化聚消積方治療本研究疾病的蛋白互作網絡(簡稱PPI網絡)，有助于從系統角度全面探索疾病的分子機制。再將STRING數據庫的結果文件，使用R語言計算各蛋白之間的連接次數，得到連接次數最多者即PPI網絡中的核心靶點。

1.4關鍵化合物 使用R語言計算化合物對應靶點的個數，對應個數越多者即關鍵化合物。并標注化合物在本復方中的中藥來源。

1.5核心靶點及關鍵化合物相互作用網絡 利用Cytoscape軟件，將選出的核心靶點與核心化合物(數量依據篩選后得到有效化合物總數量的25%)形成互相作用網絡。

1.6靶點注釋 利用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)對靶點進行注釋。UniProt數據庫由整合Swiss-Prot、 TrEMBL和PIR-PSD三大數據庫的數據而成。它的數據主要來自于基因組測序項目完成后，后續(xù)獲得的蛋白質序列，包含了大量來自文獻的蛋白質的生物功能的信息。

1.7富集分析 從基因功能和信號通路2個層面，分別利用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進行富集分析。兩種分析結果均使用R語言中ClusterProfiler包[7]計算，顯著性以P<0.05為檢驗水準，再使用EnrichPlot包對數據進行可視化。通路圖可視化結果使用Pathview包。

2 結 果

2.1化聚消積方化合物及靶點篩選結果 經數據庫檢索，得到黃芪87個、黃連48個、蒲黃33個、茵陳53個、積雪草69個、附子65個、六月雪20個化合物成分。經篩選，得到符合條件的候選化合物共82個，對應作用靶點212個。

2.2疾病靶點 搜集關于糖尿病腎病的靶點有3 082個，經剔除綜合評分5分以下的靶點后，得到1 170個靶點。

2.3PPI網絡構建 藥物靶點與疾病靶點經對照處理后，得到105個交集靶點。交集靶點結果輸入STRING數據庫后，得到關于本疾病的PPI互作網絡圖，見圖1。再利用R語言得到本網絡的核心靶點結果(見圖2)，IL6以87次的連接次數位于本網絡的首位，是本網絡中最關鍵的靶點，AKT1、VEGFA、CASP3、PTGS2等依次在后。

圖1 化聚消積方PPI網絡

圖2 化聚消積方PPI網絡核心靶點前30位

2.4核心化合物 交集靶點共對應41個化合物，表1里展示對應靶點數量前10位的化合物。附子所含的化合物成分，未排在前10位中，故單獨分析附子的化合物成分與靶點的對應關系，得到結果見圖3(橙色標簽表示化合物，藍色標簽表示靶點)，可以看到附子有4個有效成分對應了核心靶點之一的PTGS2。

圖3 附子的化合物與靶點對應網絡

表1 化聚消積方前10位核心化合物

2.5核心靶點——關鍵化合物互作網絡 選取前15位核心靶點和對應靶點數量前10位化合物，利用Cytoscape軟件展示它們之間的互作網絡，見圖4(橙色標簽表示化合物，藍色標簽表示靶點)，可以看到Quercetin/槲皮素與核心靶點的對應數量也是最多的，PTGS2則是來源化合物數量最多的核心靶點。

圖4 核心靶點—關鍵化合物互作網絡

2.6富集分析

2.6.1GO功能分析 生物過程(BP)共得到2 008條富集結果(P<0.05)，主要包括細胞對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應、活性氧代謝過程、對氧化應激的反應等。分子功能(MF)共得到143條富集結果(P<0.05)，主要包括細胞因子受體結合、類固醇結合、磷酸酶結合、核受體活性、細胞因子活性、類固醇激素受體活性等。細胞組成(CC)共得到36條富集結果(P<0.05)，主要包括 膜筏、膜區(qū)、膜微區(qū)、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、核轉錄因子復合體等。每個過程取前10條結果以氣泡圖展示，圓圈的大小表示基因富集的數量，同樣顏色由紅變藍表示P值逐漸增大，見圖5。對于生物過程(BP)，將P值由小到大前30個詞條的基因富集結果以點陣圖的形式展現(按縱軸從原點起P值由小到大排列)，可以直觀地看出每個生物過程中富集的具體基因，有助于進一步探索發(fā)現基因間的相互聯系，見圖6。

圖5 GO分析結果

圖6 GO生物過程富集基因點陣

2.6.2KEGG通路分析 結果顯示共有154條通路(P<0.05)，涉及面廣泛，取排名前20條結果，依次是：流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、TNF信號通路、人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、甲型流感、癌癥中的蛋白聚糖、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、恰加斯病(美國錐蟲病)、丙型肝炎、前列腺癌、內分泌抵抗、弓形蟲病、胰腺癌、利什曼病、瘧疾、膀胱癌，見圖7。使用Pathview包對糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路進行可視化，見圖8，可以看到紅色標簽的基因表示化聚消積方中的靶點對該通路的上調結果。

圖7 KEGG通路分析前20結果

圖8 化聚消積方對AGE-RAGE信號通路上調結果

3 討 論

中醫(yī)理論中有“異病同治，同病異治”一說，正如不同的疾病中可存在相同的通路機制，不同的通路機制可作用于同一疾病，與網絡藥理學的分析方法不謀而合。為整體系統地分析探討中藥復方的作用機制提供研究思路。

化聚消積方的核心化合物有槲皮素、山奈酚和花生四烯酸。研究發(fā)現槲皮素可通過SCAP-SREBP2-LDLr信號通路改善早期糖尿病腎病的脂質代謝以減輕早期腎臟損害[8]。槲皮素還可通過Hippo通路抑制早期糖尿病腎病的系膜細胞增殖[9]。山奈酚可抑制2型糖尿病小鼠的TNF-α-p38MAP激酶信號通路對腎臟起保護作用[10]?；ㄉ南┧崾羌毎ぶ|的主要成分，主要由環(huán)氧合酶、脂氧合酶和細胞色素P450酶代謝。基于這3種代謝途徑，花生四烯酸可以轉化為多種觸發(fā)不同炎癥反應的代謝物，在炎癥過程中對腎臟的損害中也起著至關重要的作用，如對腎小管上皮細胞的損傷[11]。

核心靶點IL-6，是一種多效細胞因子，在免疫、組織再生和代謝中起作用。2型糖尿病患者血清IL-6水平升高，IL-6和sIL-6R損害了跨不同細胞系的體外內皮細胞功能，可能對2型糖尿病相關的微血管并發(fā)癥有影響[12]。在一項關于IL-6多態(tài)性的薈萃分析中發(fā)現[13]，IL-6 rs1800795，rs1800796和rs1800797在糖尿病腎病的發(fā)展中起著重要作用。PTGS2又稱COX2，環(huán)氧合酶(COX)是負責前列腺素合成的限速酶，其存在兩種同工型： COX1和COX2。在某些組織中諸如內皮，腎臟，大腦和腫瘤細胞等中表達，與細胞黏附增加，表型改變，對細胞凋亡的抗性和腫瘤血管生成有關。在胰島素抵抗中COX2介導信號具有雙重效應[14]。其他作用靶點，如AKT1、VEGFA、CASP3等，也都在胰島素抵抗，腎小球微血管病變，調控細胞凋亡等方面與糖尿病腎病關系密切[15-17]。

KEGG通路分析發(fā)現，化聚消積方治療糖尿病腎病可能與糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗的經典通路之一MAPK信號通路、炎癥因子相關的TNF信號通路、IL-17信號通路有關。糖基化終末產物(AGEs)是細胞衰老過程中的危險分子，這些終產物在糖尿病中越來越多地合成，并且與糖尿病并發(fā)癥密切相關。它們積聚在細胞外基質中，產生氧化應激和炎癥。在微血管病變方面，引起腎臟的損傷[18]。化聚消積方可能作用于AGE-RAGE信號通路，減少糖基化產物，減輕腎臟損傷。研究發(fā)現，NRG4可通過TNF-R1信號可減弱糖尿病腎病中AGEs的表達，對糖尿病腎病中的腎小管間質纖維化具有治療作用[19]。提示化聚消積方也可能通過TNF信號通路，改善糖尿病腎病損害。

綜上所述，化聚消積方的核心化合物有槲皮素、山奈酚和花生四烯酸等。PPI網絡顯示化聚消積方中核心靶點有IL6、AKT1、VEGFA等。KEGG通路顯示存在AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。它們之間存在著復雜的，多層次的作用網絡，提示化聚消積方在治療糖尿病腎病方面機制的多樣性，將為今后開展動物及臨床試驗提供可靠依據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。