何謙益，石曉娟，連晶瑤，劉莎莎，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 4)河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052 5)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

卒中是腦血管病的一種，其中87%為缺血性卒中，也被稱為腦梗死。卒中是全球范圍內(nèi)造成患者死亡與致殘的主要原因，全球每年新增1 030萬卒中患者[1]。目前唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準使用并且在臨床使用中被證實有效的治療腦梗死的藥物是重組組織纖溶酶原激活劑(tPA)。但是由于tPA治療時間窗僅為發(fā)病后4.5 h內(nèi)，且并不能阻斷缺血后免疫損傷，因此其并不能廣泛地降低急性腦梗死的致死率與致殘率。人們?nèi)孕鑼ふ倚碌募毙阅X梗死的治療策略。近年來，越來越多的研究關(guān)注于急性腦梗死后的免疫反應，已有證據(jù)[2-3]表明在腦梗死后誘導免疫抑制可以起到神經(jīng)保護的作用。

在T細胞受體被抗原激活的同時許多共抑制分子也被激活以達到精確調(diào)節(jié)T細胞反應強度的目的，這些共抑制分子又被稱為免疫檢查點[4]。免疫檢查點不僅參與維持機體對自身抗原的免疫耐受，而且還能有效地防止免疫過度激活，從而減輕炎癥性組織損傷[5]。既往研究表明，免疫檢查點T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3[6](T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3,Tim-3)、程序性細胞死亡蛋白-1[7](programmed cell death protein-1,PD-1)和細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白-4[8](cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病中起重要的免疫抑制作用。研究[9]表明CD8+T細胞可能早在腦梗死發(fā)生3 h后就開始在梗死灶周邊聚集。不同于CD4+T細胞，CD8+T細胞主要通過釋放穿孔素和顆粒酶促進腦梗死后的炎癥反應[2]。本研究通過檢測急性腦梗死患者外周CD8+T細胞中PD-1、Tim-3和CTLA-4的表達，分析上述免疫檢查點分子陽性率與患者預后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2018年11月至2019年11月經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的急性腦梗死患者，共108例。選取同時期至該院體檢科體檢健康的90人作為健康對照。研究對象均自愿參加本研究并且簽署了知情同意書。急性腦梗死患者的納入標準為：①符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》的診斷標準，并且均經(jīng)MRI檢查確認。②神經(jīng)缺損癥狀首次出現(xiàn)，且在發(fā)病7 d內(nèi)就診。排除標準為：①妊娠或合并其他重要臟器功能不全者。②近期應用過免疫抑制劑、類固醇等藥物。③患有自身免疫性疾病、感染性疾病、癌癥等可能影響免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的疾病。

1.2 臨床資料的收集采集研究對象的臨床資料，如性別、年齡、糖尿病病史、高血壓病史、房顫病史、吸煙史、冠心病病史、飲酒史等。采集患者入院當天或第2天清晨空腹靜脈血，運用全自動生化分析儀檢測低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol， HDL-C)、甘油三酯、總膽固醇等。急性腦梗死患者均接受了為期90 d的隨訪，隨訪結(jié)束后應用modified Rankin Scale(mRS)評分評價預后，0～2分為預后好，3～5分為預后差。

1.3 CD8+T細胞中PD-1、Tim-3與CTLA-4表達的檢測取空腹靜脈血10 mL，抗凝后采用梯度-密度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。PBMC計數(shù)后取1×106個，用FACS Buffer重懸后避光加入流式抗體，包括anti-CD3、anti-CD8、anti-PD-1、anti-Tim-3和anti-CTLA-4 (Biolegend公司產(chǎn)品)，4 ℃避光孵育30 min后上流式細胞儀(BD FACS-Canto Ⅱ) 檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 23.0進行分析。兩組臨床資料比較采用t/χ2檢驗。兩組外周血CD8+T細胞中PD-1、Tim-3和CTLA-4表達的比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Logistic回歸分析急性腦梗死患者預后的影響因素。繪制ROC曲線分析CD8+T細胞中PD-1、Tim-3以及CTLA-4陽性表達率對急性腦梗死患者預后的預測價值。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料的比較結(jié)果見表1，兩組年齡、性別、既往病史、血清LDL-C、HDL-C、膽固醇與甘油三酯水平等差異均無統(tǒng)計學意義。

表1 兩組一般臨床資料的比較

2.2 兩組外周血CD8+T細胞中PD-1、Tim-3和CTLA-4的表達結(jié)果見表2。與健康對照組比較，急性腦梗死組CD8+T細胞中PD-1和CTLA-4陽性率下降。

表2 兩組外周血CD8+T細胞中PD-1、Tim-3和CTLA-4陽性率的比較 %

2.3 急性腦梗死患者不同預后組臨床參數(shù)比較根據(jù)急性腦梗死患者mRS評分，預后好43例，預后差65例。預后好組CD8+T細胞中PD-1陽性率高于預后差組。急性腦梗死患者不同預后組臨床參數(shù)比較見表3。

2.4 急性腦梗死預后影響因素的Logistic回歸分析以患者CD8+T細胞中PD-1、Tim-3、CTLA-4陽性率，性別(女=0，男=1)，年齡，吸煙史、糖尿病病史、高血壓病史(無=0，有=1)為自變量，以急性腦梗死預后為因變量(預后好為1，預后差為0)，進行Logistic回歸，結(jié)果顯示患者CD8+T細胞中PD-1陽性率是急性腦梗死預后的影響因素，PD-1陽性率越高，患者預后越好(表4)。

表4 急性腦梗死預后影響因素的logistic分析

2.5 急性腦梗死患者CD8+T細胞中PD-1、Tim-3、CTLA-4陽性表達率對預后的預測價值結(jié)果見圖1及表5。CD8+T細胞中PD-1陽性率預測患者較好預后的ROC曲線下面積為0.888(95%CI為0.825～0.951)；PD-1陽性率為13.65%時，敏感度為88.4%，特異度為80.0%。

圖1 急性腦梗死患者CD8+T細胞中PD-1、Tim-3、CTLA-4陽性表達率預測預后的ROC曲線

表5 CD8+T細胞中PD-1、Tim-3、CTLA-4陽性率對急性腦梗死預后的預測價值

3 討論

在腦梗死發(fā)生24 h后，適應性免疫反應就已經(jīng)開始激活[10]。目前普遍認為T細胞在腦梗死急性期起促進炎癥反應，加重神經(jīng)損傷的作用[2]。淋巴細胞重組研究[11]結(jié)果顯示，在腦梗死后的血栓形成以及炎癥反應中起關(guān)鍵作用的為CD8+T細胞。CD8+T細胞作為細胞毒性T細胞主要識別MHC Ⅰ類分子相關(guān)抗原。CD8+T細胞被激活后通過脫顆粒反應將蛋白顆粒酶、類似于補體C9功能的穿孔素、蛋白聚糖絲氨酸釋放至細胞間質(zhì)。穿孔素可以導致細胞穿孔，而顆粒酶可以激活凋亡途徑，最終導致神經(jīng)細胞的損傷[12]。本研究結(jié)果顯示急性腦梗死發(fā)生后CD8+T細胞中起免疫抑制功能的PD-1的表達下調(diào)，這可能與腦梗死早期CD8+T被大量激活并且主要發(fā)揮炎癥促進作用有關(guān)。既往一些研究[13-14]結(jié)果顯示，與健康人相比，急性腦梗死患者外周血CD8+T細胞中Tim-3陽性表達率沒有變化。我們的結(jié)果與上述研究一致。Zhao等[14]的研究結(jié)果顯示，急性腦梗死后Tim-3在CD4+T細胞與CD14+的單核細胞上表達上調(diào)。因此，我們推測急性腦梗死后免疫檢查點分子CTLA-4與Tim-3主要通過其他類型的免疫細胞發(fā)作免疫抑制作用。急性腦梗死患者PBMC上CTLA-4的表達率沒有變化[15]。而蔣福生等[16]發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死后CTLA-4在CD4+CD25+Treg細胞表面表達上調(diào)。本研究結(jié)果顯示急性腦梗死組CD8+T細胞中CTLA-4陽性率下降。

PD-1是表達于T細胞表面的一種抑制性受體。PD-1通過與它的兩種配體PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-CD)相互作用發(fā)揮抑制T細胞活化、增殖和細胞因子分泌的作用[17]。在小鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血模型中，PD-1途徑的激活可以限制梗死體積，減少炎癥細胞從外周招募至缺血組織，減少巨噬細胞以及小膠質(zhì)細胞的激活最終降低小鼠神經(jīng)功能損傷[18]。同時缺少PD-1配體(PD-L1與PD-L2)也可導致小鼠MCAO模型梗死面積增大，并且 PD-L1參與抑制炎癥細胞向梗死灶浸潤、減少T細胞與單核細胞激活以及抑制后續(xù)的炎癥反應，不僅如此 PD-L1還介導了腦梗死后T細胞上PD-1表達的上調(diào)[19]。對34例急性腦梗死患者以及25例正常人外周血進行RNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死發(fā)生24至48 h之后，患者外周血CLTA-4信號途徑顯著上調(diào)[20]。阿托伐他汀能通過上調(diào)CTLA-4陽性的CD4+CD25+細胞的比例來降低MCAO模型大鼠的梗死面積以及神經(jīng)功能損傷[21]。Tim-3在腦梗死患者外周血中的表達上調(diào)，并且CD4+T細胞上Tim-3的表達與IL-17的表達相關(guān)，CD14+單核細胞上Tim-3的表達與TNF-α相關(guān)，因此Tim-3可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應在急性腦梗的病理過程中起重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，PD-1在預后較好患者中的陽性率更高，并且是患者預后的獨立影響因素，與上述結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示，雖然與健康人相比，急性腦梗死患者外周血CD8+T細胞中PD-1表達下降，但是其功能仍然應該為抑制急性腦梗后炎癥反應與促進神經(jīng)修復。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)急性腦梗死后，患者外周血CD8+T細胞中PD-1表達較健康人降低;外周血CD8+T細胞中PD-1表達率可以較好預測急性腦梗死的預后，PD-1表達率越高，預后越好?？傊?，我們的研究結(jié)果提示患者外周血CD8+T細胞中PD-1可能發(fā)揮神經(jīng)保護作用。