周玉嘉 張允嶺 周 晶 田 沫 馬青科 金香蘭 張志辰△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100191；3.北京第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100026）

根據(jù)《全球疾病負(fù)擔(dān)研究》報告，中風(fēng)已成為第2大死亡原因，也是全球殘疾調(diào)整生命年的第3大原因［1］。近年來，缺血性卒中的臨床治療手段越來越多樣化，大量研究表明，血管再通是治療缺血性腦卒中的最有效手段。中風(fēng)后的腦損傷是由于流向大腦的血液中斷以及受損區(qū)域缺氧引起的［2］。然而，對于發(fā)生血栓后的組織來說血供的重建會提高損傷的程度，即缺血再灌注損傷（I/RI）［3］。炎癥是I/RI的主要機制之一［4］，神經(jīng)缺血缺氧后可激活Toll樣受體4（TLR4），激活核因子-κB（NF-κB），被激活的NF-κB可以促進(jìn)多種促炎性細(xì)胞因子合成，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），減少抑炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等釋放，擴大炎癥反應(yīng)。因此，靶向抑制TLR4/NF-κB信號通路，可降低腦組織促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，改善組織炎性損傷。

三七總皂苷是三七提取物，臨床上廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可以改善大鼠腦、心、腎等臟器I/RI損傷［5-8］。目前研究認(rèn)為，三七總皂苷對腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)機制涉及其對自由基及脂質(zhì)過氧化物、細(xì)胞凋亡、鈣通道、神經(jīng)元損傷、相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)等［6］。本研究旨在從TLR4/NF-κB信號通路及炎癥因子角度，探討三七總皂苷對腦缺血/再灌注大鼠腦組織的保護(hù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量（275±25）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，使用許可證編號：SYXK（京）2019-0013。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物中心，飼養(yǎng)級別為SPF級，5只/籠，保證正常光照節(jié)律、溫度適度、環(huán)境安靜，正常大鼠生長繁殖飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。本研究通過北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理審批（批號：2019072）。

1.2 試藥與儀器 三七總皂苷（廣西梧州制藥有限公司，生產(chǎn)批號：19060106）。大鼠線栓（廣州佳靈生物科技有限公司，規(guī)格：L3600）；大鼠IL-1β ELISA試劑盒（Abcam，ab100768）；大鼠TNF-α ELISA試劑盒（Abcam，ab100785）；大鼠IL-4 ELISA試劑盒（Abcam，ab100771）；大 鼠 IL-10 ELISA 試 劑 盒（Abcam，ab100765）；Anti-TLR4抗體（Abcam，ab217274）；Anti-NF-κB p65抗體（Abcam，ab16502）。顯微鏡（Leica公司，型號DM3000）；酶標(biāo)分析儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司，DR-200BS）；高級凝膠成像系統(tǒng)（基因有限公司，G：BOX F3）。

1.3 分組與造模 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為假手術(shù)組、模型組、中藥組各15只。模型組及中藥組建立I/RI模型。造模方法：10%水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉大鼠，麻醉成功之后，大鼠固定于操作臺，頸部正中切口，游離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，頸外動脈及結(jié)扎，夾閉頸總動脈，在大鼠做一V型切口，插入線栓并緩慢向前推進(jìn)，直至插入大腦中動脈，輕遇阻力即停止。栓塞2 h后，緩慢拔出線栓，逐層縫合大鼠傷口。假手術(shù)組不插入線栓外，其余操作與模型組及中藥組相同。造模24 h后評估模型成果，成功標(biāo)志：Longa神經(jīng)功能分級評分≥2分的大鼠為模型制備成功。剔除各組造模不成功大鼠及死亡大鼠，最終假手術(shù)組14只，模型組12只，中藥組13只。

1.4 給藥方法 中藥組大鼠尾靜脈注射三七總皂苷50 mg/kg（給藥劑量參考文獻(xiàn)［7］），模型組及假手術(shù)組給予等量0.9%氯化鈉注射液尾靜脈注射。各組給藥均每日1次，連續(xù)3 d。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評分 給藥3 d后，對所有大鼠進(jìn)行Garcia評分［8］，從大鼠自主運動、體態(tài)對稱性、前肢伸展功能、攀爬運動、身體雙側(cè)觸覺、雙側(cè)胡須碰觸反應(yīng)等6個方面評估大鼠神經(jīng)功能損傷的程度。分值為3～18分，數(shù)值越大，神經(jīng)功能損傷越輕，18分為正常。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）大鼠腦組織HE染色。各組大鼠完成神經(jīng)行為學(xué)評分后，每組隨機取3只大鼠麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，留取腦組織制作5 μm的冠狀石蠟切片。切片脫蠟、復(fù)水后進(jìn)行HE染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織形態(tài)變化。2）大鼠腦組織氯化三苯基四氮唑（TTC）染色。每組隨機取3只大鼠麻醉，生理鹽水心臟灌注，留取干凈腦組織迅速放入-20℃冰箱里冷凍，20 min后取出，冠狀位切5～6片，每片厚約2 mm。切好的腦組織用2%TTC染色液37℃孵育染色30 min，沖掉多余染色液，4%多聚甲醛固定，24 h后拍照，計算腦梗死面積。3）大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平檢測。各組剩余大鼠麻醉后迅速留取腦組織，-80℃保存用于細(xì)胞因子檢測及蛋白免疫印跡法（Wester blotting）檢測。取大鼠新鮮腦組織50 mg，在預(yù)冷PBS（0.01 mol/L，pH=7.0～7.2）中清洗去除血液，將組織切成小塊，均勻地放入放置在冰上勻漿，勻漿液4℃低溫冷凍離心機10 000 r/min離心5 min，留取上清液用于檢測。分別用IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒檢測各個大鼠腦組織細(xì)胞因子含量，具體操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。4）各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測。取30 mg大鼠腦組織剪碎，加入適量含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，置于冰上研磨，4℃低溫冷凍離心機10 000 r/min離心5 min，取上層清液為蛋白提取液，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。調(diào)整各樣本為統(tǒng)一濃度，金屬浴使蛋白變性。配備SDS-PAGE凝膠電泳，恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，用5%脫脂奶粉封閉，于室溫?fù)u床封閉1.5 h，分別加入一抗（兔抗TLR4抗體1∶300；兔抗NF-κB p65抗體1∶2 000），4 ℃過夜孵育，洗膜后加入二抗（山羊抗兔IgG HRP，1∶10000），室溫?fù)u床孵育70 min，洗膜后加入超敏ECL發(fā)光液顯色，于凝膠圖像成像分析系統(tǒng)曝光5～30 s，Image J軟件計算條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以（±s）表示，符合方差齊性，兩組對比采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較 見表1。模型組及中藥組大鼠表現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺失癥狀，如左側(cè)偏癱，行走時左側(cè)轉(zhuǎn)圈，運動減少，左前爪不能完全伸展等。對各組大鼠進(jìn)行Garcia評分，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Garcia評分顯著降低（P＜0.01），與模型組相比，中藥組大鼠Garcia評分升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較（分，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別假手術(shù)組模型組中藥組n 14 12 13 Garcia評分17.31±0.23 6.28±2.49**8.53±1.72△

2.2 各組大鼠缺血半暗帶組織形態(tài)學(xué)變化 見圖1。假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元胞體及軸突排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰可見；模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞可見壞死，細(xì)胞排列混亂，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不完整；中藥組大鼠與模型組大鼠相比神經(jīng)元凋亡情況顯著改善。

圖1 各組大鼠腦組織病理觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠腦梗死面積比較 見表2，圖2。通過Image Pro Plus軟件分析各個層面白色梗死區(qū)域的所占面積，取平均值代表大鼠梗死面積百分比。與模型組相比，中藥組大鼠腦組織梗死面積顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠大腦梗死面積比較（%，±s）

表2 各組大鼠大腦梗死面積比較（%，±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥組n 3 3 3腦梗死面積0 46.79±17.46 27.53±11.32△

圖2 大鼠腦組織梗死情況（TTC染色）

2.4 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較 見表3。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α水平顯著增高（P＜0.01），抑炎型細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平降低（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α水平顯著降低（P＜0.01），抑炎型細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥組n 8 6 7 IL-1β 16.03±2.28 39.46±5.25**27.13±4.51△△TNF-α 37.24±0.28 59.11±1.45**53.40 ±0.75△△IL-4 28.21±9.83 14.00±7.66**19.50±7.81△IL-10 12.93±3.02 7.99±2.45**11.75±2.39△△

2.5 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較 見表4，圖3。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠TLR4、NF-κB p65表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組大鼠TLR4表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。

表4 各組腦組織TLR4、NF-κB p65水平比較（±s）

表4 各組腦組織TLR4、NF-κB p65水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥組n 8 6 7 TLR4蛋白0.21±0.03 0.62±0.09**0.31±0.05△NF-κB p65蛋白0.12±0.09 0.53±0.11**0.27±0.08△△

圖3 各組大鼠TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)條帶

3 討論

炎癥是腦IR/R的主要損傷機制之一［4］。在靜息狀態(tài)下，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并處于失活狀態(tài)，當(dāng)腦缺血組織突然恢復(fù)血供后，細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基，誘導(dǎo)TLR4激活［9］，通過信號級聯(lián)擴大效應(yīng)激活 NF-κB，NF-κB被激活后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)（尤其是p65亞單位），與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合，啟動炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥。此外，活化的NF-κB還可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，同時調(diào)控其激活狀態(tài)［10-11］。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞最主要的炎癥細(xì)胞，在腦缺血后第一個做出反應(yīng)［12］。小膠質(zhì)細(xì)胞的活化存在于缺血性腦中風(fēng)的各個階段［13］，通過釋放細(xì)胞因子、趨化因子等持續(xù)影響神經(jīng)功能［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以表現(xiàn)出損傷和保護(hù)兩種截然相反的生理活性，這主要取決于小膠質(zhì)細(xì)胞活化后的狀態(tài)［16-17］。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞為促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞，主要產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、干擾素-γ（IFN-γ）、IL-6、IL-12、IL-23、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和蛋白水解酶（MMP9、MMP3）等，加劇組織炎性損傷［18］。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞為修復(fù)型小膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生促血管生成和促炎性作用的IL-4、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），以及生長因子如VEGF、BDNF、血小板衍生生長因子（PDGF）等，可以減輕組織炎癥，促進(jìn)損傷修復(fù)［19］。NF-κB對小膠質(zhì)細(xì)胞的激活主要是使小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息態(tài)轉(zhuǎn)化為M1型，還可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M2型轉(zhuǎn)化為M1型，增加IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等促炎癥因子釋放，引起組織廣泛而又持續(xù)的炎性損傷［20］。

實驗研究證實，抑制TLR4/NF-κB信號通路，可以減輕腦組織炎性損傷，預(yù)防腦IR/R［21-22］。綜上所述，抑制TLR4/NF-κB信號通路，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2轉(zhuǎn)化，可以減少促炎性細(xì)胞因子水平，增加抑炎性細(xì)胞因子水平，恢復(fù)腦組織免疫穩(wěn)態(tài)，可減少腦組織IR/R損傷。在本研究中發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可顯著縮小MCAO模型大鼠腦梗死面積，改善大鼠神經(jīng)元損傷，改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，這與既往的研究結(jié)果相同，再次印證了三七總皂苷對腦IR/R的保護(hù)作用。其機制可能與下調(diào)大鼠TLR4/NF-κB炎性信號通路，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M2型向M1型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而減少M1型小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、TNF-α表達(dá)，增加M2型小膠質(zhì)細(xì)胞IL-4、IL-10表達(dá)，減輕組織炎性損傷相關(guān)。