曹曉佳，呂安琪，張理濤，單士軍

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010050；2.廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院，福建 廈門 361101；3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

人皮膚成纖維細(xì)胞（Human dermal fibroblasts，HDF）是皮膚真皮網(wǎng)織層中最重要的細(xì)胞，其可以產(chǎn)生膠原蛋白、纖維黏連蛋白、板層素、糖胺聚糖、韌粘素等細(xì)胞外基質(zhì)。紫外線（UV）可能使成纖維細(xì)胞數(shù)量減少以及分泌合成功能下降或異常[1]，導(dǎo)致皮膚光老化，主要表現(xiàn)為皮膚粗糙、皺紋、色沉、松弛等。中波紫外線（UVB）主要引起表皮層及真皮淺層的病變。UV輻射的能量通常被細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸（DNA）所吸收并引起多種的DNA損傷及一系列信號傳導(dǎo)通路活化，產(chǎn)生生長因子或細(xì)胞因子，改變多種不同基因的表達(dá)特異性[2]，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在皮膚光老化的病理生理機(jī)制中起了核心作用，其可以特異性降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分[3]，引起皮膚光老化。

薏苡仁提取物（ESC）有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等功效[4]，有研究發(fā)現(xiàn)ESC還可以抑制環(huán)氧脂合酶以及核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)（NF-κB）的表達(dá)，進(jìn)而抑制MMPs的表達(dá)。筆者提取了原代HDF進(jìn)行體外實驗，研究ESC對UVB照射后的HDF的MMPs表達(dá)的影響，探討ESC抗光老化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 人皮膚組織由廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院獲得。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰酶購自 Biological Industries（BI），胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，薏苡仁提取物由浙江康萊特公司惠贈，RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、RT-PCR試劑購自天根生物有限公司，MTT、膠原酶、DMSO購自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀購自Biometra公司，低溫超速離心機(jī)購自Sigma公司，紫外分光光度儀購自Beckman公司，紫外照射儀購自上海希格瑪高技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 原代HDF的提取與培養(yǎng) 采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代HDF的提取，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從臨床獲取的組織，用無菌紗布包裹，迅速轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺內(nèi)，浸泡在含有雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，漂洗數(shù)次，剪去皮下脂肪，表皮面向上浸入含0.25%胰蛋白酶的培養(yǎng)基中。24 h后分離表皮與皮下組織，將真皮組織剪碎，置于含有膠原酶的10%FBSDMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每3天換液，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時傳代，第3～6代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 ESC對原代HDF增殖能力的影響 實驗采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT），分為不同濃度ESC組和對照組。將細(xì)胞以1×106/mL濃度接種于96孔板，待細(xì)胞生長融合至90%左右，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，對照組給予100μL無血清培養(yǎng)基，ESC 組分別給予含有 1、2.5、5、7.5、10 μL/mL 濃度的ESC無血清培養(yǎng)基，總體積為100 μL，孵育24 h后，加入20 μL 5 g/L的MTT，孵育4 h后棄上清，加入200 μL DMSO，室溫振蕩15 min，于490 nm波長處測定每組吸光度（A）值，計算各組細(xì)胞的增殖活力。

1.2.3 細(xì)胞紫外照射 實驗分為3組：ESC組、基質(zhì)組和模型組。各組又根據(jù)實驗照射UVB劑量的不同分為10、30、60 mJ/cm2UVB組。UVB照射采用3～6代的細(xì)胞，以1×106/mL濃度接種于6孔板，待細(xì)胞生長融合至90%左右，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，300 μL PBS形成細(xì)胞表面液膜，311 nm窄波UVB光源照射，照射距離15 cm。照射結(jié)束棄PBS，模型組給予無血清DMEM，基質(zhì)組給予含基質(zhì)的無血清DMED，ESC 組分別給予含有 ESC1、2.5、5 μL/mL 的DMEM。孵育24 h，棄上清，0.25%胰酶處理后收集細(xì)胞。

1.2.4 總RNA提取和cDNA合成 收集細(xì)胞，根據(jù)Trizol法提取RNA。測定獲取的RNA濃度和其A260/A280值。取2 μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為 20 μL，反應(yīng)條件為 5℃ 1h，99℃ 15 min，5℃5min，獲取cDNA置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增 MMP1 409 bp引物序列，上游引物5'-ATT CTA CTG ATA TCG GGG CTT TGA-3'，下游引物5'-ATG TCC TTG GGG TAT CCG TGT AG-3'。MMP 3 194 bp引物序列，上游引物 5'－TATGGATCCCCCCCTGACTCCCCTGAG-3'，下游引物5'-ATG GAA TTC AGG TTC AAGCTT CCT GAG G-3'。內(nèi)參GAPDH 313 bp引物序列，上游引物 5'-TCC，TGT，GGC，ATC，CAC，GAA，ACT-3'，下游引物 5'-GAA，GCA，TTT，GCG，GTG，GAC，GAT-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為50℃2 min，95℃3min，95℃20s，58℃20s，72℃20s，39 個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 以SPSS 22.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），Bonferroni法對數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代HDF的培養(yǎng) 顯微鏡下觀察HDF生長良好，為長梭型，細(xì)胞透明度大，均質(zhì)。見圖1。

圖1 第4代HDF圖像（×200）

2.2 ESC對原代HDF增殖的影響 MTT結(jié)果顯示：不同濃度的ESC處理原代HDF后，各組吸光度值與空白對照組相比，變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.695<0.05），說明ESC對HDF基本沒有毒性，見表1。

表1 ESC對HDF增殖活性的影響

2.3 不同劑量UVB照射后HDF中MMP1、MMP3 mRNA表達(dá)的變化 采用實時定量PCR法檢測處理前、后細(xì)胞中MMP1、MMP3 mRNA的表達(dá)水平。

分別以UVB0mJ/cm2照射組（空白組）的MMP1、MMP3 mRNA表達(dá)量為1進(jìn)行計算。結(jié)果表明4組之間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00<0.05），組間比較采用Bonferroni法檢驗，各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00<0.05），見表 2。

表2 UVB照射對HDF中MMP1、MMP3 mRNA表達(dá)的影響

2.4 ESC對UVB照射后的HDF中MMP1、MMP3 mRNA表達(dá)的影響 原代HDF采用UVB 30 mJ/cm2照射后，ESC 組加入 1、2.5、5 μL/mL 的 ESC，孵育24 h；基質(zhì)組加入 1、2.5、5 μL/mL 基質(zhì)，孵育 24 h；收集細(xì)胞，檢測MMP1、MMP3 mRNA表達(dá)的變化。

分別以空白組HDF的MMP1、MMP3 mRNA表達(dá)量為1進(jìn)行計算。結(jié)果表明7組之間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00<0.05），組間比較采用Bonferroni法檢驗。3種濃度的ESC和空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P13<0.05，P15<0.05，P17<0.05）；3 種濃度的ESC間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P35<0.05，P37<0.05，P57<0.05）；相同濃度的基質(zhì)和ESC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P23<0.05，P45<0.05，P67<0.05）；見表 3。

表3 ESC對30 mJ/cm2UVB照射后HDF中MMP1、MMP3 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

ESC是以中藥薏苡仁采用臨界萃取技術(shù)獲得，其化學(xué)成份含薏苡仁酯，并含多種微量活性物質(zhì)和必須脂肪酸，如肉豆蔻酸、蕓苔甾醇、亞油酸、生育酚、多糖類、少量維生素B1、亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸薏苡素、薏苡酯、薏苡內(nèi)酯、α-β-谷甾醇、三萜化合物等。國外研究表明，薏苡仁可協(xié)同其他藥物增強(qiáng)抗腫瘤活性，改善腸道微生物區(qū)緩解潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀等[5-6]。已有研究證明，外用對特應(yīng)性皮炎模型小鼠皮損有治療作用[7]。目前薏苡仁臨床應(yīng)用于風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、結(jié)腸炎、慢性腹瀉、功能性消化不良、皮膚病、乳腺疾病等多種疾病[8]。

HDF是皮膚真皮層中主要細(xì)胞，對皮膚UV損傷的修復(fù)有著重要作用。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKS）是參與氧化、UV等應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，其中的關(guān)健分子p38及c-Jun氨基端激酶（JNK）為主要信號通路，參與了皮膚光老化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。JNK和p38被磷酸化后最終啟動轉(zhuǎn)錄因子，使c-Jun和c-Fos的mRNA和蛋白高表達(dá)，激活A(yù)P-1，AP1為MMPs轉(zhuǎn)錄所必需，從而促使MMPs高分泌[9]。其中，MMP1可以降解Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維[10]，MMP3可以降解基底膜中的Ⅳ型膠原纖維，并部分降解其他膠原纖維[11]。UV誘導(dǎo)的MMPs可直接降解膠原，也可通過MMPs產(chǎn)生的膠原降解產(chǎn)物間接抑制膠原合成[12]。NF-κB是一種廣泛存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，正常生理條件下處于非活化狀態(tài)，而UV照射可導(dǎo)致其活化[13]?；罨腘F-κB可進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。

對于薏苡仁的藥理活性研究最為深入的是抗腫瘤作用，其能顯著抑制無胸腺裸鼠的乳腺癌的生長，已檢測到特異基因的表達(dá)變化，提示ESC能特異性抑制NF-κB誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，并且還能抑制NF-κB的一個主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)蛋白激酶C的活性[14]。因此筆者推測，ESC可以抑制環(huán)氧脂合酶以及NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而可抑制MMPs表達(dá)。

本研究中，筆者用MTT法檢測ESC對原代HDF增殖的影響，結(jié)果表明加入不同濃度ESC對的HDF的增殖能力無明顯影響。筆者選取不同輻照劑量的UVB照射體外分離培養(yǎng)的原代HDF，采用實時熒光定量技術(shù)檢測了MMP1和MMP3 mRNA表達(dá)。結(jié)果表明ESC可有效降低30 mJ/cm2UVB照射后的HDF中MMP1、MMP3基因的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且有劑量-效應(yīng)關(guān)系?？梢奅SC可以減少UVB誘導(dǎo)的MMPs表達(dá)，減少真皮層膠原纖維的降解，減輕UVB所致的氧化應(yīng)激損傷，延緩細(xì)胞光老化的發(fā)生和進(jìn)展。

近年研究表明，有些中草藥基于含有許多生物活性成分，如多糖、黃酮、微量元素、維生素、激素及類激素等，通過抗氧化應(yīng)激、抗炎性反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡、升高透明質(zhì)酸含量水平、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等延緩皮膚光老化[15]，如三七皂試R1、表沒食子兒茶酚沒食子酸酯（EGCG）、雷公藤紅素、芍藥苷、懸鉤子等。中草藥多糖成分已證實是防治光老化的重要成分，主要機(jī)制集中在增強(qiáng)清除自由基能力、促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖、降低MMPs含量、促進(jìn)膠原蛋白合成等方面[16]。筆者的研究中只做了MMPs基因的基礎(chǔ)性研究，ESC抗光老化的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步探討，也需更多的研究來驗證。本次研究為以后的ESC抗光老化相關(guān)的分子機(jī)制及動物臨床實驗研究提供了基礎(chǔ)依據(jù)，也為中草藥抗光老化的臨床治療提供了新的思路。