黃艷平，呂新翔，孫志強(qiáng)，李欣，丁文媛，韓建文

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010010）

銀屑病是一種慢性、炎癥性、復(fù)發(fā)性、系統(tǒng)性疾病，銀屑病的確切病因尚未清楚，目前認(rèn)為是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用下，導(dǎo)致疾病發(fā)生或加重[1]。銀屑病在中國(guó)的患病率約為0.47%[2]。遺傳學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)許多銀屑病相關(guān)性易感基因，其中以HLA-C*06：02與銀屑病的相關(guān)性最強(qiáng)。既往基于歐洲人群的研究發(fā)現(xiàn)ZMIZ1基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）rs1250546與銀屑病相關(guān)[3]。一項(xiàng)克羅恩病與銀屑病的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)了7個(gè)共同易感的基因位點(diǎn)，其中包括ZMIZ1基因區(qū)域的3個(gè)SNP rs1250544、rs1250559、rs1250560[4]。為研究ZMIZ1基因多態(tài)性與銀屑病的相關(guān)性，在內(nèi)蒙古地區(qū)的蒙古族和漢族人群中，選擇ZMIZ1基因區(qū)域2個(gè)SNP（rs1250546和rs1250559）及HLAC*06：02，利用二代測(cè)序及聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR-SSP）進(jìn)行基因分型，探討其與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族及漢族人尋常型銀屑病（PsV）的相關(guān)性，以及二者可能的交互作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2012年12月—2018年3月住院的漢族PsV1 030例，蒙古族PsV379例，正常對(duì)照漢族965例，蒙古族518例。抽取外周靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸二鉀（K2EDTA）抗凝，先置于-20℃預(yù)冷，然后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有患者?jīng)臨床及病理證實(shí)診斷，符合PsV診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有對(duì)照排除銀屑病及其他自身免疫性疾病，排除銀屑病家族史。本研究已通過(guò)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在實(shí)施過(guò)程中遵守赫爾辛基宣言，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。PsV患者中漢族：1 030例，男532例，女 498 例，平均年齡（45.49±17.11）歲；蒙古族：379例，男204例，女175例，平均年齡（42.34±15.12）歲。正常對(duì)照中漢族：965例，男542例，女423例，平均年齡（45.86±11.59）歲；蒙古族：518 例，男 275例，女 243例，平均年齡（40.78±12.48）歲。2組性別、年齡比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在病例及對(duì)照中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P>0.05）。

1.1.2 多形性位點(diǎn)選擇 根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道，在ZMIZ1基因區(qū)域選擇2個(gè)SNP[rs1250546（10：79272775）和 rs1250559（10：79293803）]及 HLA-C*06：02。

1.2 方法

1.2.1 基因組脫氧核糖核酸（DNA）提取 利用基因組DNA提取試劑盒（中國(guó)康寧生命科學(xué)有限公司）提取患者及對(duì)照組基因DNA，利用分光光度儀分別于260 nm和280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，計(jì)算DNA濃度，并用凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，所有DNA樣本均合格。

1.2.2 基因分型

1.2.2.1 二代測(cè)序法

①引物設(shè)計(jì)及合成：利用美國(guó)國(guó)立圖書(shū)館數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），對(duì)需要實(shí)驗(yàn)分型的基因相關(guān)信息進(jìn)行查詢。然后使用Primer3 online（version 0.4.0；http：//frodo.wi.mit.edu/，USA）軟件和 Oligo[version 6.31；Molecular Biology Insights，Inc.（DBA Oligo，Inc.）USA]。軟件設(shè)計(jì)2個(gè)遺傳變異位點(diǎn)的基因分型引物、檢測(cè)探針以及測(cè)序引物（引物序列合成均由上海翼和生物公司完成）。引物序列，見(jiàn)表1。

表1 二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)中各SNP位點(diǎn)引物序列

②聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增及二代測(cè)序：模板DNA經(jīng)過(guò)構(gòu)建待測(cè)DNA文庫(kù)、多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物純化、文庫(kù)進(jìn)行單克隆擴(kuò)增及對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行再純化。純化后的PCR產(chǎn)物采用二代測(cè)序方法，Miseq測(cè)序平臺(tái)上機(jī)測(cè)序?qū)x擇的遺傳變異進(jìn)行基因分型、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、判讀結(jié)果。（注：測(cè)序工作均由上海翼和生物公司完成）。

1.2.2.2 PCR-SSP對(duì)HLA-C*06：02分型實(shí)驗(yàn)

①設(shè)計(jì)引物：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)HLA-C*06：02基因型設(shè)計(jì)引物序列，見(jiàn)表2。

表2 HLA-C*06：02基因型引物序列

②PCR擴(kuò)增反應(yīng)、凝膠電泳分析：模板DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)、擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物6 μL，3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像觀察分析PCR產(chǎn)物的電泳效果，判讀結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有SNP分析數(shù)據(jù)質(zhì)控、等位基因及基因型頻率比較采用PLINK1.07軟件（http：//pngu.mgh.harvard.edu/purcell/pink/）[5]。計(jì)算2個(gè)SNP及HLA-C*06：02的等位基因頻率和基因型頻率，在病例和對(duì)照中分別進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測(cè)。采用χ2檢驗(yàn)比較患者組及對(duì)照組等位基因頻率及基因型頻率，并計(jì)算等位基因的比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 等位基因頻率比較 與對(duì)照組相比，rs1250559_C、rs1250546_T在漢族PsV患者中的頻率差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而在蒙古族PsV患者中，rs1250559_C的頻率（33.5%）高于對(duì)照組（27.7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[χ2=6.43，P<0.05，OR=1.31，95%CI（1.06-1.62）]；rs1250546_T的頻率（48.5%）高于對(duì)照組（43.4%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[χ2=4.71，P<0.05，OR=1.23，95%CI（1.02-1.49）]，見(jiàn)表3。

表3 尋常型銀屑病患者與對(duì)照組ZMIZ1基因上2個(gè)SNP等位基因頻率比較

2.2 分別以基因型、顯性遺傳模式、隱性遺傳模式下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP與漢族PsV仍無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。而在蒙古族PsV患者中rs1250559_C在隱性遺傳模式下顯示有相關(guān)性（χ2=6.35，P=0.012，OR=1.88），見(jiàn)表4；rs1250546_T在顯性遺傳模式下顯示有相關(guān)性（χ2=5.13，P=0.024，OR=1.40），見(jiàn)表 5。

表4 顯性及隱性遺傳模式下PsV患者與對(duì)照組中rs1250559基因型分析

表5 顯性及隱性遺傳模式下PsV患者與對(duì)照組中rs1250546基因型分析

2.3 HLA-C*06：02 與 rs1250559_C、rs1250546_T交互作用與PsV的相關(guān)性分析

在蒙古族樣本中，分別以HLA-C*06：02陽(yáng)性和陰性樣本中分別進(jìn)行分析。HLA-C*06：02陽(yáng)性樣本中，與對(duì)照組相比，rs1250559_C在蒙古族PsV患者中的頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.47，P<0.05，OR=1.42）。而在HLA-C*06：02陰性樣本中，其等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。rs1250546_T在HLA-C*06：02陽(yáng)性、陰性的樣本中，等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在漢族樣本中，2個(gè)SNP在HLA-C*06：02陽(yáng)性及陰性的PsV患者和對(duì)照組比較，等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表6。

表6 HLA-C*06：02與PsV患者ZMIZ1基因rs1250559_C、rs1250546_T相關(guān)性分析

3 討論

銀屑病是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，目前研究已發(fā)現(xiàn)許多銀屑病相關(guān)性易感基因。ZMIZ1基因是位于染色體10q22.3上，通過(guò)編碼PIAS家族蛋白，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的活性，如雄激素受體（AR）、Smad3/Smad4、P53 等[6-8]。ZMIZ1 下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β是一種有多種免疫抑制特性的多效性細(xì)胞因子，其對(duì)胚胎發(fā)育、器官形成、細(xì)胞的增殖、分化及凋亡有重要調(diào)節(jié)作用，其中Smad蛋白是TGF-β信號(hào)通路激活的關(guān)鍵點(diǎn)。TGF-β抑制許多生物學(xué)過(guò)程，包括T細(xì)胞增殖、T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、輔助性T淋巴細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的T細(xì)胞刺激功能[9-10]。而TGF-β在體外則能促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的分化[11]。

目前，ZMIZ1基因上已有多個(gè)SNP位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)與多種疾病相關(guān)，包括多種皮膚?。ㄣy屑病[3]、白癜風(fēng)[12]）、腫瘤（皮膚鱗狀細(xì)胞癌[13]、前列腺癌[14]、乳腺癌[15]、直腸癌[16]等）、自身免疫性疾病（炎癥性腸?。17]、代謝性疾?。?型糖尿病）[18]、藥物治療效果相關(guān)（甲氨蝶呤治療青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的治療反應(yīng)評(píng)估）等[19]。

本研究結(jié)果顯示，蒙古族PsV患者中，rs1250559_C的頻率（33.5%）高于對(duì)照組（27.7%），（OR=1.31）；rs1250546_T的頻率（48.5%）高于對(duì)照組（43.4%），（OR=1.23）；而在漢族PsV患者中 rs1250559_C、rs1250546_T的頻率與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)研究目錄對(duì)歐洲白種人薈萃分析總結(jié)發(fā)現(xiàn)rs1250546_A（ZMIZ1） 與銀屑病相關(guān) （P=5.1×10-4，OR=1.10），rs1250559_A（ZMIZ1）也與銀屑病的相關(guān)（P=4.58×10-6，OR=0.82），并且發(fā)現(xiàn)ZMIZ1是銀屑病和克羅恩病的共同易感基因[3-4]。而在中國(guó)漢族人群中也發(fā)現(xiàn)了ZMIZ1與炎癥性腸病的相關(guān)性[17]。

筆者進(jìn)一步根據(jù)不同遺傳模式下進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，蒙古族PsV患者中rs1250546_T在顯性遺傳模式下顯示有相關(guān)性，而rs1250559_C在隱性遺傳模式下顯示有相關(guān)性。這一結(jié)果提示2個(gè)SNP可能以不同的遺傳模式影響銀屑病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在以HLA-C*06：02陽(yáng)性、陰性進(jìn)行分層分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，rs1250559_C在HLA-C*06：02陽(yáng)性的蒙古族樣本中與PsV有相關(guān)性，而在HLA-C*06：02陰性的蒙古族樣本中，未發(fā)現(xiàn)其與PsV的相關(guān)性。而另一個(gè)SNP（rs1250546）在分層后未發(fā)現(xiàn)與蒙古族PsV的相關(guān)性。這一結(jié)果提示，rs1250559可能與HLAC*06：02存在交互作用，rs1250559_C和 HLAC*06：02陽(yáng)性的共同存在可能增加了蒙古族PsV的易感性。而在漢族樣本中，以等位基因、基因型、不同遺傳模式、HLA-C*06：02分層分析均未發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP與PsV的相關(guān)性。ZMIZ1基因變異如何影響PsV易感性目前仍不能確定，通過(guò)實(shí)驗(yàn)筆者推測(cè)ZMIZ1基因與HLA-C*06：02可能存在交互作用，可增加銀屑病的易感性。由于HLA-C*06：02是銀屑病最強(qiáng)的遺傳易感因素，推測(cè)ZMIZ1可能通過(guò)與HLA-C相互作用影響銀屑病的易感性。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)ZMIZ1基因區(qū)域2個(gè)SNP（rs1250559、rs1250546）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析研究，證實(shí)了其與蒙古族PsV易感性相關(guān)，并且以不同的遺傳模式影響銀屑病易感性，并且與HLA-C*06：02可能存在相互作用，從而影響蒙古族PsV的易感性。未發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP與漢族PsV的相關(guān)性。結(jié)合既往研究，這些結(jié)果提示ZMIZ1基因與PsV的相關(guān)性在不同人群中可能存在遺傳異質(zhì)性。本研究仍存在一些不足之處：①由于樣本量有限，有假陽(yáng)性或者假陰性結(jié)果的可能，不能排除rs1250559、rs1250546與漢族PsV的相關(guān)性；②本研究?jī)H分析了ZMIZ1基因的2個(gè)SNP，該基因區(qū)域可能還存在其他銀屑病相關(guān)的易感變異；③這2個(gè)SNP并非編碼區(qū)功能變異，其如何影響其基因功能以及如何影響免疫系統(tǒng)功能仍未知，需要進(jìn)一步的功能學(xué)研究。