蒲俊華 陳大偉 劉茵茵 李惠嘉 陸俊賢 張小燕 唐夢君 唐修君 高玉時*

(1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)院，泰安 271018)

近幾十年來，隨著冶金、電池等工業(yè)的快速發(fā)展，環(huán)境中重金屬包括鎘的污染加劇[1]。鎘可在土壤、水體等環(huán)境中長期存在，并可隨生物鏈遷移至植物、動物和人體中[2]，在組織中蓄積，半衰期長達(dá)25～30年[3]。鎘可對機(jī)體的大腦、肝臟、腎臟等重要器官造成嚴(yán)重?fù)p傷[4-5]，著名的痛痛病就是由鎘引起的[6]。鎘因其較強(qiáng)的毒性而被國際癌癥分類研究機(jī)構(gòu)(international agency for research on cancer classification，IARC)列為Ⅰ類致癌物[7]。

鑒于鎘的嚴(yán)重危害性，我國《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)中對鎘的含量范圍做出了限定(≤0.5 mg/kg)。相關(guān)的研究調(diào)查表明，農(nóng)業(yè)土壤中鎘的超標(biāo)率較高，飼料包括飼料原料、預(yù)混料、全價配合飼料等均存在有鎘超標(biāo)的情況[8-10]。許多研究已證實(shí)鎘可造成家禽生產(chǎn)性能的下降，損害家禽機(jī)體，同時禽產(chǎn)品內(nèi)殘留的鎘會對人體造成潛在的食品安全隱患[11-13]。針對此種狀況，采取相應(yīng)的措施防控家禽生產(chǎn)中重金屬鎘的污染是家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的趨勢。目前已有研究報道，利用微生物對重金屬的吸附性來減除人和動物體內(nèi)的重金屬。如Zhai等[14-15]發(fā)現(xiàn)，志愿者服用8周的益生菌后，植物乳桿菌CCFM8610顯著降低志愿者血液鎘含量，而動物試驗(yàn)表明植物乳桿菌CCFM8610抑制鎘在小鼠體內(nèi)的吸收，顯著促進(jìn)糞便中鎘的排出，顯著降低組織中鎘含量。Dubey等[16]報道，益生菌戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)GS4可通過糞便排出鎘，減少鎘在小鼠組織的沉積，從而減輕鎘的毒性，保護(hù)肝臟和腸道。目前篩選具有抗鎘性能的益生菌在小鼠上的研究應(yīng)用相對較多，但在家禽養(yǎng)殖上的研究應(yīng)用很少見。在本研究的前期工作中，篩選出了1株耐鎘乳酸菌，添加于蛋雞飼糧中提高了蛋雞的生產(chǎn)性能，顯著改善了鎘暴露導(dǎo)致的蛋雞脾臟萎縮，同時顯著降低了心臟鎘的殘留量[17-18]。因此，本研究進(jìn)一步探究耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞的體重、臟器系數(shù)、組織鎘和礦物元素(鈣、鐵、鋅、銅、錳、硒)含量的影響，為將其開發(fā)應(yīng)用于家禽生產(chǎn)中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 耐鎘乳酸菌

試驗(yàn)采用的耐鎘乳酸菌從雞腸道分離出，經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定為約氏乳桿菌，命名為約氏乳桿菌Cd3-1，采用液體乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS)于37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h后，用無菌生理鹽水將其稀釋為1×109CFU/mL的菌液備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

選取健康活潑、體重均一的1日齡如皋黃雞30只，隨機(jī)分為3組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)1只雞。預(yù)試期2周，正試期4周。基礎(chǔ)飼糧參考我國《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1?；A(chǔ)飼糧中鎘含量實(shí)測值為0.066 mg/kg。預(yù)試期第1周飼喂含抗生素(那西肽，飼糧中添加量為2.5 mg/kg，以降低雛雞早期腸道的不利影響)的基礎(chǔ)飼糧，預(yù)試期第2周及正試期飼喂無抗生素的基礎(chǔ)飼糧。對照組試驗(yàn)雞第3～6周灌喂1 mL/(d·只)無菌生理鹽水；鎘暴露組試驗(yàn)雞第3～6周灌喂1 mL/(d·只)無菌生理鹽水，并在第4～6周飲水中添加5 mg/L鎘；鎘+耐鎘乳酸菌組試驗(yàn)雞第3～6周灌喂1 mL/(d·只)耐鎘乳酸菌液(1×109CFU/mL)，并在第4～6周飲水中添加5 mg/L鎘。飲水中鎘以氯化鎘(CdCl2，純度≥99.99%，賽默飛世爾科技公司，美國，貨號：100228375)形式添加，具體操作為稱取0.407 7 g的CdCl2溶解于超純水中并定容于50 mL容量管，配制成鎘濃度為5 g/L的母液，使用時用超純水稀釋為鎘濃度為5 mg/L的試驗(yàn)雞飲用水。試驗(yàn)在江蘇省家禽科學(xué)研究所動物試驗(yàn)雞舍開展，3組試驗(yàn)雞帶不同顏色翅號，同組試驗(yàn)雞同籠飼養(yǎng)。常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集及指標(biāo)測定

生產(chǎn)性能：觀測記錄正試期各組試驗(yàn)雞生長狀況和死淘情況，稱量并記錄各組全部試驗(yàn)雞每周末體重。

樣品采集：待第6周末各組試驗(yàn)雞全群稱過體重后，屠宰后取胸肌及內(nèi)臟組織(肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、心臟)，并稱量內(nèi)臟組織。各樣品凍存于-20 ℃，備測。

臟器系數(shù)按以下公式計算：

臟器系數(shù)(%)=(臟器重/活體重)×100。

鎘、鈣、鐵、鋅、銅、錳、硒含量的測定：各組織樣品分別取0.6 g，加5 mL硝酸(優(yōu)級純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)和1 mL 30%雙氧水(分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)，微波消解儀(MARS，美國CEM公司)消解，趕酸儀(bhw-09c20，培安有限公司)140 ℃趕酸至溶液剩余0.5 mL，超純水轉(zhuǎn)移定容至25 mL容量瓶，上機(jī)測定各元素含量。其中鐵、鋅、鈣含量用原子吸收分光光度計(AA800，美國珀金埃爾默股份有限公司)測定，銅、錳、硒及鎘含量用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS，XSERIES 2，美國賽默飛世爾科技公司)測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞體重的影響

整個正試期，各組試驗(yàn)雞精神狀態(tài)良好，各組均無死淘雞。如表2所示，鎘暴露組仔雞體重與對照組無顯著差異(P>0.05)，鎘+耐鎘乳酸菌組仔雞體重與對照組也無顯著差異(P>0.05)。

表2 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞體重的影響

2.2 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞臟器系數(shù)的影響

表3可知，各組之間肝臟、腎臟、肺臟和脾臟系數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。鎘暴露組和鎘+耐鎘乳酸菌組心臟系數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)，且鎘暴露組和鎘+耐鎘乳酸菌組之間心臟系數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

表3 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞臟器系數(shù)的影響

2.3 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞組織中鎘含量的影響

表4可知，鎘暴露組的各組織中鎘含量顯均顯著高于對照組(P<0.05)，且各組織中鎘含量的高低依次為腎臟>肝臟>脾臟>肺臟>心臟>胸肌。鎘+耐鎘乳酸菌組的各組織中鎘含量均低于鎘暴露組，其中鎘+耐鎘乳酸菌組的肝臟、腎臟、脾臟中鎘含量較鎘暴露組分別下降了31.6%(P>0.05)，14.5%(P>0.05)和39.8%(P<0.05)。鎘+耐鎘乳酸菌組的肺臟、心臟和胸肌中鎘含量與鎘暴露組和對照組差異不顯著(P>0.05)。

表4 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞組織中鎘含量的影響

2.4 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞組織中鈣、鐵、鋅、銅、錳和硒含量的影響

由表5可知，各組之間肝臟中鈣、鐵、鋅、銅和錳含量無顯著差異(P>0.05)。鎘+耐鎘乳酸菌組肝臟中硒含量顯著低于對照組和鎘暴露組(P<0.05)。

表5 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞組織中鈣、鐵、鋅、銅、錳和硒含量的影響

各組之間腎臟中鈣、鐵、鋅、銅和錳含量無顯著差異(P>0.05)。鎘+耐鎘乳酸菌組和鎘暴露組腎臟中硒含量顯著低于對照組(P<0.05)。

各組之間肺臟中鐵和硒含量無顯著差異(P>0.05)。鎘暴露組肺臟中鈣含量顯著高于對照組和鎘+耐鎘乳酸菌組(P<0.05)，而鎘+耐鎘乳酸菌組和對照組之間肺臟中鈣含量無顯著差異(P>0.05)。鎘+耐鎘乳酸菌組和鎘暴露組肺臟中鋅含量顯著低于對照組(P<0.05)。鎘+耐鎘乳酸菌組肺臟中銅含量顯著低于對照組(P<0.05)。鎘暴露組肺臟中錳含量顯著高于對照組和鎘+耐鎘乳酸菌組(P<0.05)。

各組之間脾臟中鐵、鋅、錳和硒含量無顯著差異(P>0.05)。鎘+耐鎘乳酸菌組脾臟中鈣和銅含量顯著低于對照組和鎘暴露組(P<0.05)。

各組之間心臟中鐵、鋅、銅和錳含量無顯著差異(P>0.05)。鎘暴露組心臟中鈣含量顯著低于對照組(P<0.05)，鎘+耐鎘乳酸菌組心臟中鈣含量與對照組無顯著差異(P>0.05)。鎘+耐鎘乳酸菌組和鎘暴露組心臟中硒含量顯著高于對照組(P<0.05)。

各組之間胸肌中鈣、鐵、鋅、銅、錳和硒含量無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞體重的影響

3.2 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞臟器系數(shù)的影響

在動物試驗(yàn)中，尤其是在一些毒理學(xué)試驗(yàn)中，臟器系數(shù)是重要的觀測指標(biāo)。一方面臟器系數(shù)的變化可反映出毒性物質(zhì)對臟器的綜合毒性作用，當(dāng)臟器發(fā)生退行性萎縮或充血、水腫等增大變化，其臟器系數(shù)會發(fā)生相應(yīng)的改變；另一方面，臟器系數(shù)發(fā)生了改變的臟器可為尋找毒物作用的靶器官提供重要線索[24]。重金屬鎘作為一種毒性物質(zhì)，當(dāng)其從外界進(jìn)入動物機(jī)體并在其體內(nèi)蓄積時，會對動物的臟器造成損傷，致其臟器系數(shù)產(chǎn)生變化。汪紀(jì)倉等[25]研究表明，腹腔注射鎘溶液致大鼠肝臟和腎臟系數(shù)顯著增加，而睪丸系數(shù)顯著降低。曹瓊潔等[26]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量氯化鎘導(dǎo)致小鼠肝臟系數(shù)顯著升高，而低劑量氯化鎘導(dǎo)致腎臟系數(shù)顯著升高。本試驗(yàn)中，仔雞鎘暴露后，心臟系數(shù)顯著降低，而補(bǔ)加耐鎘乳酸菌未改善心臟系數(shù)的降低。有研究報道，鎘顯著降低產(chǎn)蛋雞的脾臟系數(shù)，補(bǔ)加耐鎘乳酸菌則使脾臟系數(shù)恢復(fù)正常[18]。研究結(jié)果的不同說明鎘對處于不同生理期雞的臟器影響程度不同，而補(bǔ)加的耐鎘乳酸菌對鎘暴露雞的臟器產(chǎn)生的保護(hù)作用效果不同。

3.3 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞組織中鎘含量的影響

腎臟和肝臟是動物機(jī)體代謝的重要組織，也是鎘毒性作用的最主要靶器官[4]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，仔雞鎘暴露后，各組織中鎘含量量均顯著高于對照組，而腎臟和肝臟中鎘含量遠(yuǎn)高于其他組織。補(bǔ)加耐鎘乳酸菌顯著降低了脾臟中鎘含量，且肝臟中鎘含量亦著減少的趨勢。另有研究表明，耐鎘乳酸菌顯著減少鎘暴露蛋雞的心臟中鎘含量，其他組織中鎘含量也呈降低趨勢，且隨耐鎘乳酸菌劑量的增加，鎘含量消減趨勢也更明顯[18]。Jafarpour等[27]研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌和植物乳桿菌CNR273可以抵抗小鼠急性鎘毒性，降低肝臟和腎臟中鎘含量。有研究指出，益生菌可能通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜與鎘結(jié)合，促進(jìn)鎘在糞中的排出，從而降低肝腎中鎘含量[28]。Zhai等[15]研究認(rèn)為，植物乳桿菌CCFM8610減少小鼠肝臟中鎘含量的原因在于植物乳桿菌CCFM8610通過腸肝循環(huán)促進(jìn)鎘在腸道的排出。

大部分口服方式處理的鎘通過糞便排泄[28]，而吸收進(jìn)入體內(nèi)的鎘有50%～70%通過血液運(yùn)輸至腎臟和肝臟沉積。Djurasevice等[29]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠鎘暴露同時補(bǔ)加嗜酸乳酸桿菌Rosell-11、嗜酸乳酸桿菌Rosell-52與長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)Rosell-175混合菌后，糞便中鎘含量增加，組織和血液中鎘含量下降，且三者間存在強(qiáng)相關(guān)性，表明益生菌通過糞便加速鎘的排出。此外，戊糖片球菌GS4[16]以及嗜酸乳酸桿菌[30]對小鼠的試驗(yàn)結(jié)果均表明，益生菌的使用使試驗(yàn)動物糞便中鎘含量增加，而組織中鎘含量下降。綜合這些研究結(jié)果表明，益生菌通過與鎘結(jié)合促進(jìn)鎘在糞便中的排出是減少鎘在組織中沉積的主要機(jī)制。

耐鎘益生菌對動物體內(nèi)鎘的去除能力與其對鎘吸附能力的強(qiáng)弱相關(guān)，不同的菌株吸附鎘的差異性較大。Bhakta等[31]從環(huán)境樣品中篩選出5株抗鎘的乳酸菌，其中1株為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)Cd70-13，其鎘去除率最高，達(dá)到25%，并表現(xiàn)出在魚腸道中高存活率和高吸收鎘的潛力。與普通的益生菌相比，耐鎘益生菌發(fā)揮其吸附鎘的優(yōu)勢還在于其對鎘的高耐受性。當(dāng)益生菌能耐受鎘的最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)超過100 mg/L時，則認(rèn)為其對鎘有耐受性[32]。Zhai等[33]研究表明，與低耐受鎘的植物乳桿菌CCFM191(最低抑菌濃度=10 mg/L)相比，高耐受鎘的植物乳桿菌CCFM8610(最低抑菌濃度>1 000 mg/L)高耐受鎘的機(jī)制可能與幾個方面因素相關(guān)：1)植物乳桿菌CCFM8610具有特殊的能量守恒生存模式，在其面對鎘暴露時能保持內(nèi)在均衡的生理狀態(tài)；溫和誘導(dǎo)的細(xì)胞防御和修復(fù)系統(tǒng)使其在鎘暴露時避免劇烈的生理反應(yīng)而存活下來；2)疏水氨基酸的生物合成增加，提高細(xì)胞表面疏水性，阻止鎘誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)損傷；3)天然優(yōu)良的鎘結(jié)合能力和有效的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其將鎘固定在細(xì)胞表面，阻止其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中；4)對離子通道的嚴(yán)密監(jiān)管以適應(yīng)鎘誘導(dǎo)的滲透應(yīng)激；自身有幾個在其耐受性中有潛在作用的關(guān)鍵蛋白，包括前噬菌體P2b蛋白18、鈣dA、mntA和lp_3327等。本研究中所選用的約氏乳桿菌Cd3-1是從5株耐鎘乳酸菌中篩選而得，其最高可耐受1 000 mg鎘，對pH為6或7的50 mg/L的鎘溶液中的鎘吸附率超過或接近30%，表明其具有良好的鎘吸附性能。

3.4 耐鎘乳酸菌對鎘暴露仔雞組織中鈣、鐵、鋅、錳、銅和硒含量的影響

礦物元素鈣、鐵、鋅、錳、銅和硒是動物生長過程中必需的營養(yǎng)元素，有著重要的生理生化功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鎘暴露對這些元素在仔雞組織中代謝影響程度不同，其中影響較大的是硒。硒是抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心組成成分，而谷胱甘肽過氧化物酶可清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基和過氧化物，從而對細(xì)胞起到抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[34-35]。鎘暴露致仔雞腎臟硒含量顯著減少。腎臟是鎘毒性作用最主要的靶器官，鎘對腎臟的損傷主要是氧化應(yīng)激，硒含量的減少意味著谷胱甘肽過氧化物酶活性降低，細(xì)胞清除鎘對腎臟細(xì)胞造成的過氧化應(yīng)激產(chǎn)物的能力下降，表明腎臟中殘留的鎘已對腎臟細(xì)胞造成損傷。補(bǔ)加耐鎘乳酸菌使腎臟硒含量有所增加，但仍顯著低于對照組，表明補(bǔ)加的耐鎘乳酸菌劑量不足以對抗腎臟鎘蓄積帶來的損害。而與此不同的是，鎘暴露使心臟硒含量顯著增加。與腎臟相比，心臟中鎘含量相對較低，少量的鎘刺激心臟細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)水平提高，使谷胱甘肽過氧化物酶活性增加，因而硒含量也相應(yīng)增加。此前的相關(guān)研究也證實(shí)產(chǎn)蛋雞鎘暴露后血液中總抗氧化能力顯著增加[18]。補(bǔ)加耐鎘乳酸菌使心臟中硒含量進(jìn)一步增加，增強(qiáng)了心臟的抗氧化功能。

除硒外，仔雞鎘暴露對組織中鈣、鋅、錳含量均有一定影響，而對鐵、銅含量無顯著影響。鈣、鋅、錳與鎘同屬二價離子，鎘借助二價離子通道與鈣、鋅、錳競爭結(jié)合金屬硫蛋白而進(jìn)入組織，同時可取代它們與一些輔酶等結(jié)合[36]。李浪等[37]報道，鎘可能抑制產(chǎn)蛋雞鈣的腸道吸收，增加糞便和尿中鈣的排出，進(jìn)而致蛋雞出現(xiàn)鈣的負(fù)平衡。另有研究表明，鎘暴露顯著降低產(chǎn)蛋母雞腎臟中鈣含量[18]。本研究中，鎘暴露顯著降低了仔雞心臟中鈣含量，顯著升高了肺臟中鈣含量。這些研究結(jié)果的差異除與鎘的劑量相關(guān)外，還可能與機(jī)體對鈣的生理需求不同有關(guān)系。母雞在產(chǎn)蛋期需要大量的鈣，而飼糧提供了充足的鈣，保證其在機(jī)體內(nèi)的快速周轉(zhuǎn)利用。仔雞處于生長期，也需要較多的鈣用于骨骼生長，而無產(chǎn)蛋期母雞鈣在骨骼的沉積與動員的交替過程。補(bǔ)加耐鎘乳酸菌通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜吸附部分鎘，減少鎘與其他二價金屬離子競爭結(jié)合金屬硫蛋白，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)二價金屬離子的代謝作用。本試驗(yàn)中，補(bǔ)加耐鎘乳酸菌后與鎘暴露組相比，顯著增加了心臟中鈣含量，與對照組無顯著差異，表明耐鎘乳酸菌改善了鎘暴露導(dǎo)致的心臟中鈣含量的降低。耐鎘乳酸菌對鎘暴露導(dǎo)致的肺臟中鋅和錳的代謝變化的調(diào)控效果不同，補(bǔ)加耐鎘乳酸菌使肺臟中錳含量與對照組無顯著差異，未改善肺臟中鋅含量的降低，這可能與鎘與鋅是同列元素，兩者在理化性質(zhì)上相似性更多相關(guān)。

4 結(jié) 論

① 仔雞鎘暴露時，心臟系數(shù)顯著降低，肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、心臟和胸肌中鎘含量顯著增加，腎臟中硒含量和心臟中鈣含量顯著降低。

② 補(bǔ)加耐鎘乳酸菌對鎘暴露導(dǎo)致的仔雞心臟系數(shù)降低無改善作用，但可降低脾臟中鎘含量，亦有降低肝臟中鎘含量的趨勢，并增加了心臟中硒和鈣含量。