王海波 秦士貞 李金錄 武真邑 龔莉媛 裴文剛 車育彥 楊敏敏 史兆國(guó)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

鋅作為家禽維持機(jī)體正常生理和生化代謝所必需的第一限制性微量元素，為六大酶類的組分或輔助因子，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育、監(jiān)視、應(yīng)答中發(fā)揮調(diào)控功能，維持淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，參與特異性或非特異性免疫反應(yīng)及金屬酶的催化調(diào)控發(fā)揮重要功能[1-5]。但飼糧中常以硫酸鋅(ZnSO4)為鋅源，其吸收利用率低，過度排放到環(huán)境中易造成鋅污染[3]。蒙脫石屬于2∶1型層狀硅鋁酸鹽礦物，每層結(jié)構(gòu)由2個(gè)共頂聯(lián)接的硅氧四面體片中間夾著1個(gè)共棱聯(lián)接的鋁氧八面體片構(gòu)成，已探明其儲(chǔ)量位居世界第一，且具有表面積大及強(qiáng)離子交互性，畜牧生產(chǎn)實(shí)踐中常用來抗腹瀉、治療腸道疾病，還可以作為控釋載體、吸附劑[6-7]。研究顯示，通過離子交換對(duì)沸石、蒙脫石等黏土礦物富集微量元素，可使微量元素在動(dòng)物腸道內(nèi)合理釋放，持久被機(jī)體利用，提高微量元素的利用率，減少微量元素對(duì)環(huán)境的污染[8]，改善腸道形態(tài)與結(jié)構(gòu)，提高腸黏膜的免疫功能[5]，緩解細(xì)菌造成氧化應(yīng)激[9]，降低肉雞沙門氏菌和大腸桿菌的數(shù)量，提高沙門氏菌感染肉雞腸道的免疫能力[10]。同時(shí)，載鈣蒙脫石能有效扭轉(zhuǎn)黃曲霉毒素B1(AFB1)對(duì)肉鴨造成的免疫抑制，提高免疫器官指數(shù)及血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)的含量[11]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，鋅和載鋅沸石增強(qiáng)肉雞、仔豬的免疫功能[10,12]。然而，脾臟作為動(dòng)物機(jī)體最大的免疫器官，參與產(chǎn)生抗體和初始免疫球蛋白、防御素、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等細(xì)胞因子，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫發(fā)揮應(yīng)答調(diào)控[13-14]。添加載鋅沸石可改善肉雞微量元素代謝與生產(chǎn)性能[5]；本試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，肉雞玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧中添加40 mg/kg(以鋅含量計(jì))的載鋅蒙脫石(zinc-montmorillonite, Zn-MMT)對(duì)肉雞42日齡平均日增重?zé)o顯著影響，但顯著降低肉雞料重比，提高十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度(VH)和絨毛高度/隱窩深度(V/C)，促進(jìn)腸道發(fā)育[15]；且低蛋白質(zhì)水平飼糧添加Zn-MMT相比添加ZnSO4，可顯著提高肉雞免疫器官指數(shù)，提高小腸VH和V/C，降低隱窩深度(CD)，促進(jìn)肉雞腸道發(fā)育[16]。Zn-MMT作為飼料添加劑對(duì)肉雞免疫調(diào)控及含鋅酶活性的研究相對(duì)較少。因此，本試驗(yàn)旨在研究低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞免疫功能及肝臟含鋅酶活性的影響，為Zn-MMT作為飼料添加劑在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用載鋅蒙脫石經(jīng)蘭州中檢科測(cè)試技術(shù)有限公司檢測(cè)，鋅含量為10 408.80 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取1日齡健康科寶公雛240只，按體重隨機(jī)分成5組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只仔雞。對(duì)照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，4個(gè)試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中替代預(yù)混料載體(次粉)添加20、40、60和80 mg/kg Zn-MMT(均以鋅含量計(jì)算)。

1.3 飼養(yǎng)管理

2019年10月26日至2019年12月7日在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)訓(xùn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，試驗(yàn)期為42 d。試驗(yàn)采用3層籠養(yǎng)。飼養(yǎng)管理和常規(guī)免疫按照《科寶肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)》進(jìn)行。采用24 h恒定光照，雞只自由采食、飲水。

1.4 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)及NRC(1994)配制為玉米-豆粕型粉料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量的測(cè)定

在試驗(yàn)第42天時(shí)，每組選取6只接近平均體重的肉仔雞進(jìn)行翅下靜脈采血5 mL，離心管分裝，-20 ℃保存，并送于北京華英生物技術(shù)研究所用免疫比濁法測(cè)定血清免疫球蛋白(Ig)A和IgM含量，并通過酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-4、IL-2、IL-1β、干擾素-γ(IFN-γ)含量。

1.5.2 空腸黏膜IgG、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量的測(cè)定

在試驗(yàn)第21和42天時(shí)，每組選取6只接近平均體重的肉仔雞收集空腸黏膜，液氮速凍后，在-80 ℃冰箱中保存，并送甘肅碩聯(lián)生物技術(shù)有限公司采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定空腸黏膜IgG、sIgA含量。

1.5.3 肝臟含鋅酶活性的測(cè)定

在試驗(yàn)第21和42天時(shí)，每組選取6只接近平均體重的肉仔雞采集肝臟組織，液氮速凍后，在-80 ℃冰箱中保存，并送甘肅碩聯(lián)生物技術(shù)有限公司采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定肝臟銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)活性。

1.5.4 脾臟免疫相關(guān)基因表達(dá)

表2 目的基因及內(nèi)參基因引物

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013處理后，采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，P<0.05表示顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量的影響

由表3可見，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著影響血清中IFN-γ的含量(P<0.05)，但對(duì)血清中IgA、IgM、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6的含量無顯著影響(P>0.05)。相比CK組，添加40和60 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞血清中IFN-γ的含量(P<0.05)。

表3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)42日齡肉雞血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量的影響

2.2 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞空腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

由表4可見，相比CK組，低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞21和42日齡空腸黏膜的IgG、sIgA的含量均無顯著影響(P>0.05)。

表4 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞空腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

2.3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞肝臟含鋅酶活性的影響

由表5可見，相比CK組，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著影響肉雞21和42日齡肉雞肝臟中Cu-Zn SOD活性(P<0.05)，但對(duì)ALP、LDH、MDH活性均無顯著影響(P>0.05)。相比CK組，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著提高肉雞21和42日齡肉雞肝臟中Cu-Zn SOD活性(P<0.05)。

表5 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞肝臟含鋅酶活性的影響

2.4 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞脾臟免疫功能的影響

由表6可見，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著影響肉雞42日齡脾臟核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65(NF-κBp65)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-2(TRAF-2)、腫瘤壞死因子受體超家族1(TNFRSF1B)、核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β4(TFG-β4)、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。相比CK組，低鋅飼糧添加40 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞脾臟NF-κBp65、TRAF-2、TNFRSF1B、IκB-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，但對(duì)TFG-β4、IFN-γ基因相對(duì)表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。同時(shí)，低鋅飼糧添加20 mg/kg Zn-MMT顯著提高肉雞脾臟TNFRSF1B基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，且添加80 mg/kg Zn-MMT顯著提高肉雞脾臟TRAF-2、IL-1β、IL-6基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

表6 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞脾臟免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量的影響

機(jī)體許多器官和系統(tǒng)都受到鋅缺乏的負(fù)面影響。在體內(nèi)，幾乎先天免疫和適應(yīng)性免疫的所有方面都受到鋅的影響，缺鋅能改變中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的數(shù)量和功能，這表明鋅在免疫防御方面具有重要意義[22]。免疫球蛋白參與介導(dǎo)體液免疫，其功能隨含量升高而增強(qiáng)[23-24]。細(xì)胞因子在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間起到雙向通信的作用的可溶性小分子多肽[25-26]，由Thl細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ及TNF-α等協(xié)助T細(xì)胞的增殖，啟動(dòng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[27]；而Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，參與體液免疫[28]；以及活化的巨噬細(xì)胞分泌的IL-1、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α等多種細(xì)胞因子[29]，共從參與機(jī)體的免疫調(diào)控。詹小立等[23]研究發(fā)現(xiàn)，改性蒙脫石對(duì)斷奶仔豬血清IgG、IgA和IgM含量無顯著差異；但血清中IL-2含量的升高，能夠促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生[30]。在本試驗(yàn)中，相比對(duì)照組，低鋅飼糧添加40和60 mg/kg的Zn-MMT對(duì)血清IL-2的含量有提高的趨勢(shì)，且添加40和60 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞血清中IFN-γ的含量，雞IFN-γ可針對(duì)不同的病原感染與相應(yīng)的細(xì)胞因子協(xié)同作用進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，完成免疫系統(tǒng)的防御功能[31]，有效提高免疫功能。

3.2 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞空腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

家禽腸道中的sIgA能與微生物和黏膜中的抗原結(jié)合，限制微生物和抗原進(jìn)入腸道，IgM參與機(jī)體原發(fā)性免疫反應(yīng)，使可溶性抗原發(fā)生沉淀，提高機(jī)體吞噬、清除抗原的能力，維持腸道免疫屏障功能[32-34]。研究證實(shí)，鋁硅酸鹽可提高小鼠白細(xì)胞的吞噬活性，刺激脾臟B淋巴細(xì)胞分化，指導(dǎo)免疫球蛋白合成[35]。載鋅沸石[36]、凹凸棒石[37]、凹凸棒石和沸石混合物[38]等均能提高空腸黏膜中IgG、sIgA含量，增強(qiáng)腸道免疫力。但本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞空腸黏膜免疫球蛋白含量無顯著差異，這可能與Zn-MMT覆蓋在健康腸道黏膜表面，減少了抗原對(duì)黏膜表面的直接刺激，使腸道免疫系統(tǒng)處于較低的免疫激活狀有關(guān)[39]。

3.3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞肝臟含鋅酶活性的影響

鋅在動(dòng)物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，適量補(bǔ)鋅可影響動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶活性和金屬硫蛋白表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)動(dòng)物機(jī)體免受自由基損傷，其中最具有代表性的為酶催抗氧化Cu-ZnSOD和糖代謝中的ALP[3,5,40]；并緩解機(jī)體因重金屬中毒、細(xì)菌、球蟲感染導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，增加肝臟中Cu-ZnSOD活性[10,41-42]，且對(duì)MDH活性[43]有提高趨勢(shì)，但對(duì)LDH活性影響表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。飼糧中添加0.11%～0.46%載鋅沸石可增加蛋雞肝臟ALP、MDH活性，且LDH活性在0.23%時(shí)最高，隨后呈下降趨勢(shì)[40]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肝臟ALP、LDH、MDH活性均無顯著影響，這與馬芳[44]的研究不同鋅水平對(duì)肉雞ALP、LDH活性無顯著影響的結(jié)果相似。但與李林楓[40]在蛋雞中添加載鋅沸石提高肝臟ALP、LDH、MDH活性的研究結(jié)果出現(xiàn)差異。其原因可能是基礎(chǔ)飼糧中的鋅能夠滿足肉雞ALP、LDH、MDH對(duì)鋅的正常需求，且劉澤輝[43]報(bào)道發(fā)現(xiàn)，鋅水平對(duì)肉雞肝臟MDH活性無顯著影響。陳志敏等[45]的研究表明，飼糧中添加硫酸鋅顯著影響肝臟Cu-ZnSOD活性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著提高肉雞21和42日齡肉雞肝臟中Cu-ZnSOD活性，這與陳剛耀[3]在肉雞中添加載鋅沸石提高肝臟中Cu-ZnSOD活性研究結(jié)果相似。硅酸鹽黏土中金屬離子能在動(dòng)物胃腸道內(nèi)緩慢釋放，持久維持組織細(xì)胞中鋅含量，并參與維持Cu-ZnSOD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，抑制有害菌增殖，防止蛋白質(zhì)或氨基酸巰基的氧化，減少機(jī)體在代謝過程中產(chǎn)生的羥自由基[10,46-48]。

3.4 低鋅飼糧添加Zn-MMT對(duì)肉雞脾臟免疫功能的影響

鋅對(duì)維持動(dòng)物機(jī)體的免疫器官的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用，缺鋅或鋅過量會(huì)直接造成免疫器官萎縮或病變、免疫細(xì)胞數(shù)減少、抗體含量降低[46]。脾臟作為動(dòng)物機(jī)體最大的免疫器官，參與機(jī)體免疫調(diào)控，經(jīng)T淋巴細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞主導(dǎo)的NF-κB通路調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)，同時(shí)參與胚胎發(fā)育、淋巴細(xì)胞生成及調(diào)控骨形成；NF-κB通常被隔離在未受刺激的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，與IκB結(jié)合形成一個(gè)保守的三聚體復(fù)合物p50-p65-IκB，掩蓋了核定位序列，核定位序列暴露后能與IκB-α核導(dǎo)出序列結(jié)合，使IKB-α與NF-κB二聚體的復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)穿梭運(yùn)動(dòng)，轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與其相應(yīng)的DNA序列結(jié)合從而促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。另外，TRAF能直接或間接與受體結(jié)合，介導(dǎo)NF-κB通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[49-51]。IL-4和IL-10通過Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB和其他信號(hào)通路調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以維持腸道健康的抗炎因子[52-54]。陳娜娜等[55]研究結(jié)果表明，適量的蛋氨酸鋅可顯著增加蛋雞盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量，顯著減少大腸桿菌數(shù)量，但1 400 mg/kg蛋氨酸鋅反而極顯著增加了大腸桿菌數(shù)量，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，生物屏障遭到破壞；且雙歧桿菌[56]能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化成熟，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖并參與T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及LAK的細(xì)胞分化，促進(jìn)機(jī)體免疫器宮的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟。羅有文[46]研究發(fā)現(xiàn)，一定量的載鋅凹土可以抑制肉雞空腸大腸桿菌的增殖，并適當(dāng)增加乳酸桿菌的數(shù)量。本試驗(yàn)研究表明，相比CK組，肉雞低鋅飼糧添加40 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞脾臟NF-κBp65、TRAF-2、TNFRSF1B、IκB-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10基因相對(duì)表達(dá)量。體內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)與動(dòng)物免疫之間的關(guān)系極為密切。Zn-MMT進(jìn)入動(dòng)物腸道后，可以吸附其中的氨、氨氣等極性分子，為嗜酸性的乳酸桿菌提供更優(yōu)良的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)了有益菌的增殖，改善了腸道微生態(tài)系統(tǒng)，維持機(jī)體免疫功能。

4 結(jié) 論

① 低鋅玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧中添加Zn-MMT可提高21和42日齡肉雞肝臟Cu-ZnSOD活性，增強(qiáng)肝臟抗氧化能力；但對(duì)42日齡肉仔雞血清和空腸黏膜中免疫球蛋白含量無顯著影響。

② 低鋅玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧中添加40 mg/kg的Zn-MMT可顯著提高脾臟免疫相關(guān)基因的表達(dá)。