董穎，張鶴，張玉堯，潘黛安，魏星華，趙大慶（.魯西南醫(yī)院有限公司，山東 聊城 5300；.長春中醫(yī)院大學附屬醫(yī)院，長春 300；3.吉林省科普服務中心，長春 300）

哈蟆油為蛙科動物中國林蛙Rana temporaria chensinensisDavid 雌蛙的輸卵管，為滋補藥材，具有補腎益精、健脾益胃、滋陰補腎、潤肺生津等功效。中國林蛙的輸卵管呈不規(guī)則彎曲，位于腹腔中下位兩側，全長呈現(xiàn)粗細不均勻，近肺根段較細，中段漸漸加粗，近子宮段輸卵管較粗且略扁，其長度一般為體長的4 ～8 倍，質量為體質量的20%～26%[1]；呈現(xiàn)乳白色或黃白色，干品偶帶有灰白色薄膜狀的干皮，呈脂肪樣光澤，手摸有滑膩感，質硬且易斷；有特殊的油脂氣味和腥味，味微甘，嚼之有黏滑感；膨脹度大于55；其主要成分為蛋白質，含量約占50%以上[2]。常見的偽品黑斑蛙的輸卵管（青蛙油）外觀性狀為不規(guī)則彎曲，中間灰黑色瓣膜，管徑均一，透明；白色或黃白色，有脂肪樣光澤；質脆易碎，手摸之稍有油脂狀潤滑感；味辛辣，嚼之麻嘴、黏牙；膨脹度大于55；其主要成分為蛋白質，含量約為47.5%[3]。在目前的研究中，偽品青蛙油與正品哈蟆油性狀上相似，不易區(qū)別，但通過顯微、薄層色譜等方法可以進行鑒別[4]。至今研究顯示哈蟆油中特異性的成分僅有1-甲基海因，但目前在青蛙油中也發(fā)現(xiàn)含有該成分[5]。本研究采用iTRAQ技術和質譜分別建立和比較哈蟆油和青蛙油的蛋白質組數(shù)據(jù)庫，篩選兩個種屬蛙在冬眠前輸卵管中蛋白組成的差異。

1 材料

1.1 樣品采集

哈蟆油的基源動物為中國林蛙長白山亞種，保護地域為吉林省長白山區(qū)域。林蛙采于吉林省蛟河市前進鄉(xiāng)（東經(jīng)127°40′18.4′，北緯43°54′20.9′）、永吉縣北大湖鎮(zhèn)（東經(jīng)126°30′14′，北緯43°27′53′）、舒蘭市上營鎮(zhèn)（東經(jīng)127°15′43.9′，北緯44°8′25.2′）、樺甸市紅石砬子鎮(zhèn)（東經(jīng)127°6′26.5′，北緯42°57′17.7′）、集安市清河村（東經(jīng)125°55′58.2′，北緯41°25′59.5′）和安圖縣三道灣鎮(zhèn)（東經(jīng)129°10′19.5′，北緯43°9′29.2′），海拔在500 ～1000 米。黑斑蛙（青蛙）采自于吉林省永吉縣北大湖鎮(zhèn)（東經(jīng)126°30′14′，北緯43°27′53′）和吉林市（東經(jīng)126°25′17′，北緯44°4′40′）兩個地區(qū)，海拔在100 ～300 米。中國林蛙和黑斑蛙均經(jīng)長春中醫(yī)藥大學藥學院肖井雷副教授鑒定為正品。

1.2 儀器與試藥

Q Exactive 質譜儀（Thermo 公司）；AKTA Purifier 100 蛋白純化儀、數(shù)控600V 電泳儀（通用GE Healthcare 公司）；5430R 型低溫高速離心機、真空離心濃縮儀（德國Eppendorf 公司）；胰蛋白酶（Promega 公司）；iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit（美國AB SCIEX 公司）；丁香酚（Sigma，純度：98%，批號：E2069）。

2 方法[6-7]

2.1 林蛙和黑斑蛙的輸卵管（蛙油）摘取

分別取活蛙，沿腹部正中線解剖，取出輸卵管，去除筋膜、肉、卵等雜物，用蒸餾水反復清洗至呈乳白色或黃白色，置于陰涼干燥處晾干，研缽研磨成粉末。哈蟆油樣品：5 個產(chǎn)地各取10 只混合后準確稱量100 mg 后混勻；青蛙油樣品：兩個產(chǎn)地分別取10 只混合，準確稱量100 mg，混勻。

2.2 蛙油中蛋白質的提取和含量測定

兩個蛙油樣品各準確稱取10.0 mg，分別加入1 mL SDT 裂解液，勻漿后沸水浴5 min，超聲破碎10 min，14 000 g 室溫離心45 min，取上清液，－80℃保存?？捡R斯亮藍法測定兩個蛙油樣品中蛋白質的含量，哈蟆油蛋白質的質量濃度分別為8.83 μg·μL－1和7.09 μg·μL－1，青蛙油蛋白質的質量濃度為6.59 μg·μL－1。

2.3 iTRAQ 定量分析

每份樣品各取250 μg，胰酶消化，酶解后的肽段用8 標iTRAQ 試劑中的113、114 和115 進行標記。采用二維液相（納升流速HPLC 液相系統(tǒng)Easy nLC 和強陽離子交換液相色譜）進行分離，每份樣品經(jīng)分離后用Q-Exactive 質譜儀進行分析[8]。

2.4 哈蟆油與青蛙油差異蛋白質篩選

對哈蟆油蛋白質組數(shù)據(jù)庫中1220 個蛋白質組在樣本哈蟆油113（A）/REF 和114（B）/REF與青蛙油115（C）/REF 中的定量信息進行差異分析，篩選條件為比值＞1.5（或比值＜0.67），且P＜0.05。

2.5 生物信息學分析

2.5.1 Gene Ontology（GO）功能注釋分析 在GO 注釋過程中，Blast 2 GO 通過比較目標序列和比對序列的相似性、GO 條目來源的可靠性和GO有向無環(huán)圖的結構，將map 過程中提取的GO 功能條目中符合條件的條目注釋給目標蛋白質。

2.5.2 WEGO 注釋分析 利用WEGO 軟件對鑒定到的差異蛋白質的細胞學組件、生物學途徑和分子功能完成GO 注釋，比較青蛙油（C/REF）與哈蟆油（/REF）差異蛋白質進行WEGO 分析。對GO 2 層次進行匯總。

2.5.3 KEGG 通路注釋 利用KAAS（KEGG automatic annotation server）數(shù)據(jù)庫將目標蛋白質序列與KEGG GENES 數(shù)據(jù)庫中的兩棲綱蛋白質序列進行比對，通過同源/相似蛋白質的KO 號注釋到相關KEGG 通路上。

3 結果

3.1 青蛙油與哈蟆油差異蛋質白質篩選結果

對青蛙油與哈蟆油中蛋白質定量的數(shù)據(jù)進行差異比較，篩選出差異表達蛋白質總數(shù)為55 個，其中上調的蛋白質數(shù)為40 個（見表1），下調的蛋白質數(shù)為15 個（見表2）。

表1 青蛙油與哈蟆油相比上調的蛋白質Tab 1 Up-regulated proteins in the proteomics database of OCB compared with that of ORN

表2 青蛙油與哈蟆油相比下調的蛋白質Tab 2 Down-regulated proteins in the proteomics database of OCB compared with that of ORN

3.2 青蛙油中含量較高的差異蛋白質（上調蛋白）

參與能量代謝過程的蛋白質包括羥酰基輔酶A脫氫酶三官能多酶復合體亞基β（HADHB）、乙酰輔酶A 合成酶（AACS）、烏頭酸水合酶（ACO1）、煙酰胺磷酸核糖轉移酶s 同源體（NAMPT）和羥酰輔酶A 脫氫酶Ⅱ型（HSD17B10）等。參與糖代謝的蛋白質包括半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶（GALT）、血漿a-L-巖藻糖苷酶（FUCA2）和磷酸葡萄糖變位酶（PGM1）等。參與應激反應的蛋白質包括鳥嘌呤核苷酸結合蛋白a 亞基14（GNA14）、L-乳酸脫氫酶A 鏈（LDHA）、血紅素結合蛋白（HPX）和蛋白酶體亞基α-3 型（PSMA3，PSMA5）等。參與生長發(fā)育相關的蛋白質包括LUC7-like、核孔復合物蛋白（NUP93）和高速泳動族蛋白B2（HMGB2）等。參與生物合成的蛋白質包括核糖體蛋白（RPS26）、不均一核核糖核蛋白質A1 樣亞型1（HNMPA1）和絲氨酸轉運RNA 連接酶（SARS1）等。參與細胞骨架形成的蛋白質包括細絲蛋白（FLNB）和驅動蛋白重鏈（KIF）等。參與氧化還原的蛋白質包括1，2-二羥基-3-酮-5-甲基硫戊烯雙加氧酶（ADI1）和微粒體谷胱甘肽s-轉移酶3 S 同源體（MGST3）等。參與免疫調節(jié)相關的蛋白質包括腺苷脫氨酶2（ADA2）。

3.3 哈蟆油中含量較高的差異蛋白質（下調蛋白）

3.4 WEGO 注釋分析結果

3.4.1 細胞組分分析 從圖1細胞組分中可以看出青蛙油與哈蟆油比較差異蛋白質表達體現(xiàn)在細胞、細胞器、膜、大分子復合體、膜封閉腔和胞外區(qū)，分別占所有差異蛋白質的34%、23%、16%、16%、8%和3%。

圖1 差異蛋白質細胞組分分析Fig 1 Cellular components of differentially expressed proteins

3.4.2 分子功能分析 從圖2分子功能中可以看出催化活性、結合功能、結構分子活性、酶調節(jié)活性、化學引誘物活性、載體活性、核酸結合轉錄因子活性、抗氧化活性和分子轉導活性是青蛙油與哈蟆油差異蛋白質比較集中的9 類功能，其中催化活性和結合功能類蛋白質最多，分別占所有差異蛋白質的43%和42%。

圖2 差異蛋白質分子功能分析Fig 2 Molecular function of differentially expressed proteins

3.4.3 生物學途徑分析 從圖3生物學途徑中可以看出繁殖、免疫系統(tǒng)過程、代謝過程、細胞過程、信號、多組織過程、發(fā)育過程、生長過程、位移運動、單組織過程、刺激反應、定位、多生物過程、生物調節(jié)和細胞成分組織/生物合成是青蛙油與哈蟆油差異蛋白質比較集中的15 個生物學途徑，其中參與代謝過程、細胞過程、單組織過程和生物調節(jié)的蛋白質數(shù)量較多，分別占所有差異蛋白質的21%、19%、12%和10%。

圖3 差異蛋白質生物學途徑分析Fig 3 Biological process of differentially expressed proteins

3.5 青蛙油與哈蟆油差異蛋白質KEGG 代謝通路分析

青蛙油與哈蟆油的差異蛋白質總數(shù)為55 個，其中29 個差異蛋白質map 到77 條KEGG 信號/代謝通路中；在這29 個差異蛋白質中，27 個上調蛋白map 到76 條KEGG 信號通路中，兩個下調蛋白map 到8 條KEGG 信號通路中。

與哈蟆油蛋白質數(shù)據(jù)比，青蛙油中含量較高（即上調）的27 個差異蛋白質中鈉/鉀離子轉運ATP 酶亞基α1 肽（ATP1A1）參與cGMP-PKG 信號通路（cGMP-PKG signaling pathway）、唾液分泌（salivary secretion）、心肌細胞腎上腺素能信號轉導（adrenergic signaling in cardiomyocytes）、胰島素分泌（insulin secretion）、甲狀腺激素合成（thyroid hormone synthesis）等16 個代謝過程；PGM1 參與糖酵解/糖異生途徑（glycolysis/gluconeogenesis）、磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway）、半乳糖代謝（galactose metabolism）、嘌呤代謝（purine metabolism）等7 個代謝過程；Ⅰ型膠原蛋白a1 鏈（COL1A1）參與焦點黏連（focal adhesion）、ECM 受體相互作用（ECM-receptor interaction）、血小板活化（platelet activation）等6 個代謝過程；ACO1 參與三羧酸循環(huán)（citrate cycle）、乙醛酸和二羧酸代謝（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、原核生物固碳過程（carbon fixation pathways in prokaryotes）、碳代謝（carbon metabolism）等6 個代謝過程；HADHB 參與脂肪酸降解（fatty acid degradation），脂肪酸伸長（fatty acid elongation），纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（valine，leucine and isoleucine degradation），苯甲酸降解（benzoate degradation）和脂肪酸代謝（fatty acid metabolism）等5 個代謝過程；LDHA 參與糖酵解/糖異生途徑（glycolysis/gluconeogenesis）、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism）、丙酸代謝（propanoate metabolism）等4 個代謝過程。

在差異蛋白質富集分析中發(fā)現(xiàn)，半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）均富集到3 個差異蛋白質（GALT、PGM1、UDP2）。糖酵解/糖異生途徑富集到兩個差異蛋白質LDHA 和PGM1。嘌呤代謝（purine metabolism）富集到兩個差異蛋白質PNP 和PGM1。半胱氨酸和甲硫氨酸代謝富集到兩個差異蛋白質ADI1 和LDHA。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解富集到兩個差異蛋白質HADHB 和HSD17B10。

哈蟆油中含量較高（即下調）的兩個差異蛋白質包括LOC398139 protein，CD63 antigen。其中LOC398139 protein 參與三羧酸循環(huán)（citrate cycle）、乙醛酸和二羧酸代謝（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、原核生物固碳過程（carbon fixation pathways in prokaryotes）、氧代羧酸代謝（2-oxocarboxylic acid metabolism）和氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）等6 個代謝過程。CD63 antigen 參與溶酶體（lysosome）和癌癥過程蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）等兩個代謝過程。

其他差異蛋白質在KEGG 代謝通路中未被注釋到。

4 討論與結論

4.1 青蛙油中含量較高的差異蛋白質與環(huán)境、生長發(fā)育的關系

成年黑斑蛙常棲息于稻田、池溏、湖澤、河濱、水溝內(nèi)或水域附近的草叢中。一般10月開始冬眠，鉆入向陽的坡地或離水域不遠的田地、溝埂、塘埂土層30 ～40 cm 深處穴居冬眠，次年4月后出蟄[9]。冬眠前青蛙油中含量較高的差異蛋白質（即上調成分）與黑斑蛙平時的棲息環(huán)境、冬眠環(huán)境可能存在密切關系。

鳥嘌呤核苷酸結合蛋白（GNA14）是在膜結合受體和細胞內(nèi)效應器之間起信號傳遞作用，可水解GTP 生成GDP，具有GTP 酶活性，在哺乳動物細胞中G 蛋白和其受體形成一個最普遍的信號系統(tǒng)，在哺乳動物的各種組織中均有表達，如腦、心臟、胚胎等組織。參與調節(jié)感官感知[10]、細胞生長、激素的分泌和釋放[11]、防御物質的信號傳導[12]及脂肪體中能源物質的使用[13]。有研究表明，在低氧或缺氧的胚胎中GNA14 高表達，可調節(jié)高血壓和內(nèi)皮細胞的功能[14-15]。因此認為GNA14 在蛙冬眠過程中調節(jié)機體機能，適應環(huán)境方面起到重要作用。

血紅素結合蛋白（HPX）是肝臟合成的一種急性時相反應蛋白，在血漿中與游離的血紅素結合能力最強，廣泛參與機體多種生理和病理過程。機體內(nèi)游離的血紅素是有害的，可以破壞脂質雙分子層，促進低密度脂蛋白轉化成具有細胞毒性的氧化產(chǎn)物[16]，還可以插入紅細胞膜，縮短紅細胞的壽命，加速溶血的發(fā)生[17]，HPX 可以結合和轉運有毒的游離血紅素至肝臟而發(fā)揮解毒作用。Grinberg 等[18]研究發(fā)現(xiàn)HPX 與血紅素結合后，血紅素誘導的氧自由基明顯減少，過氧化活性下降80%～90%，脂質過氧化活性也顯著降低，進而達到抗氧化的作用。目前研究結果顯示HPX 還具有維持體內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)[19]、保護神經(jīng)[20]等功能。在黑斑蛙冬眠過程中，高含量的HPX降解機體產(chǎn)生的毒素-血紅素，同時起到抗氧化的作用。

羥?；o酶A 脫氫酶三官能多酶復合體亞基β（HADHB）是一種具有多功能的膜結合型蛋白酶，可以催化3 種酶活性（長鏈烯酰輔酶A 水合酶、長鏈3-羥烷基輔酶A 脫氫酶和長鏈3-?；o酶A 硫解酶），參與脂肪酸和脂質代謝過程，在線粒體中參與長鏈脂肪酸的β氧化過程產(chǎn)生能量[21-22]。ACO1 也稱烏頭酸酶，廣泛分布于動植物和微生物中，在肝臟、腎臟、肌肉、前列腺中含量特別高。在三羧酸循環(huán)中，ACO1 為催化檸檬酸和異檸檬酸之間相互轉換的輔酶[23]。GALT具有催化、連接活性，參與半乳糖代謝過程[24]。在KEGG 代謝通路中， 筆者發(fā)現(xiàn)ATP1A1、PGM1、ACO1、HADHB、GALT 和LDHA 是青蛙油中重要的差異蛋白質，主要參與體內(nèi)的各種糖代謝、糖異生、氨基酸代謝、脂肪代謝等代謝過程。

綜合以上青蛙油中差異的蛋白結構、活性特點可以看出，部分蛋白質是參與胚胎細胞生長、發(fā)育的重要物質基礎，部分蛋白質在蛙冬眠過程中提供能量，是維持生命活動的重要成分，為冬眠期和翌年的排卵期做準備。

4.2 哈蟆油中含量較高的差異蛋白質的特點與環(huán)境、生長發(fā)育的關系

中國林蛙冬眠期主要在水下，這個特點是中國林蛙所特有的，其他種類的蛙一般都在泥土中冬眠。同時在東北中國林蛙最早結束冬眠，比黑斑蛙、蟾蜍等蛙類早20 ～30 d。本文通過比較青蛙油與哈蟆油蛋白質組學的差異，發(fā)現(xiàn)哈蟆油中蛋白成分差異主要為a-激酶錨定蛋白13 類似蛋白、免疫球蛋白Fc 段連接蛋白和黏蛋白，且此3 類成分在哈蟆油中表達量較高，對哈蟆油的功能活性起到至關重要的作用。

a-激酶錨定蛋白13 類似蛋白（AKAP13-like），AKAP13 包含兩個重要的結構域（PKA 結構域和GEF 結構域），在許多信號傳導中發(fā)揮著重要的作用，能激活GTP 酶Rho，水解GTP 為GDP。AKAP13 可將PKA、PKD、PKC 多蛋白復合物錨定于細胞骨架肌動蛋白[25-26]，在PKD 和Rho 通路中起著整合cAMP 信號的作用；AKAP13將PKD 與其上游激活因子PKC 連接，PKC 磷酸化PKD，使其激活，而PKA 磷酸化AKAP13，促進激活的PKD 從AKAP 復合物平臺上游離出來。AKAP13 在多個器官和組織中高表達，如脾、胸腺、外周血白細胞、骨路肌和睪丸；胎盤和肺中適度表達；而在肝、腦、小腸、結腸和前列腺癌中沒有或者少量表達[27]。目前研究顯示AKAP13 通過GEF 作用，參與心肌肥大的形成[28]。邢修業(yè)[29]研究AKAP13 在小鼠卵泡發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)AKAP13 基因敲除雜合型小鼠的生殖能力降低，表明AKAP13 可能通過作用于FSHR 信號通路下游效應分子參與并影響FSHR信號通路，進而在小鼠卵泡發(fā)育中起至關重要的作用。免疫球蛋白Fc 段連接蛋白（IgGFc binding protein，F(xiàn)cγBP）主要在胎盤和結腸的上皮細胞表達，作為黏膜的組成部分，維持黏膜的結構。FcγBP 類似黏蛋白，具有黏蛋白的結構特點，同時具有免疫球蛋白連接的活性，在黏膜免疫系統(tǒng)和炎癥中具有重要的作用[30]。Kobayashi 等[31]報道FcγBP 存在于血清中，在各種自身免疫性疾病的患者中高水平表達。黏蛋白（mucin）是分布在各種管腔內(nèi)表面的高分子量糖蛋白，對上皮細胞起到重要的保護和潤滑的作用，黏蛋白中的糖鏈在維持蛋白質的穩(wěn)定、抵抗蛋白酶水解、防止抗體識別等方面發(fā)揮重要的作用[32]。近年來，發(fā)現(xiàn)黏蛋白還參與細胞增殖的調控、受精，上皮細胞的分化、更新，調節(jié)細胞黏附、細胞信號轉導等過程[33]。Mucin2、Mucin-5AC 和Mucin-5B 屬于凝膠形成型的黏蛋白，具有形成凝膠的能力，結構中包含半胱氨酸富含區(qū)域，經(jīng)二硫鍵連接形成二聚體，因此其分子量較高不溶于水[34]。人類Mucin2（包含5179aa）有超過100 個不同寡糖修飾后形成的糖蛋白[35]，糖分子產(chǎn)生一個高度異構的黏蛋白凝膠層，形成一個天然的防御機制，在腸道內(nèi)，帶電的糖鏈能有效地控制水分子，形成一個穩(wěn)定的環(huán)境保護半透膜[36]。Mucin-5B 主要在呼吸道黏膜腺體的黏液細胞中表達，在舌下腺高度表達，在頜下腺、子宮內(nèi)膜、膽囊和胰腺也有表達，有助于唾液和宮頸黏液的潤滑和彈性的作用。在胃和呼吸道上皮細胞中Mucin-5AC 通過結合吸入的微生物和微粒，隨后被黏液系統(tǒng)清除，來保護黏膜，防止感染和化學損傷[36]。當卵子通過輸卵管時即被腺體所分泌的膠狀物所包裹，為卵提供豐富的營養(yǎng)物質，此類膠狀物多為黏蛋白[37]，因林蛙剛出蟄后，溫度較低、缺乏食物等為其提供營養(yǎng)物質，輸卵管作為重要的生殖器官，分泌大量的膠狀物質，達到保護卵子的作用。以上結果提示在哈蟆油中高表達的蛋白質主要參與免疫調節(jié)、細胞骨架形成、生殖發(fā)育等過程。

哈蟆油本身具有高的膨脹度與其含有大量的、多種類型的凝膠型黏蛋白密切相關。黏蛋白凝膠的程度會受到各種因素的影響，包括黏蛋白自身分子量大小、糖基側鏈長短、聚合度和濃度以及外界因素如pH、離子強度的變化等。由于黏蛋白和免疫球蛋白Fc 段連接蛋白都包含大量的糖鏈結構，對于哈蟆油膨脹的能力具有重要的影響。

4.3 結論

中國林蛙與黑斑蛙的生活習性不同導致哈蟆油與青蛙油中蛋白質含量的差異，本研究通過比較青蛙油與哈蟆油蛋白質組數(shù)據(jù)庫的差異，篩選到差異表達蛋白質55 個，其中上調的蛋白質數(shù)為40 個，下調的蛋白質數(shù)為15 個。哈蟆油中含量較高的15 差異蛋白質主要參與免疫調節(jié)、細胞骨架形成和生殖發(fā)育等過程；而青蛙油中含量較高的40 個差異蛋白質主要參與能量代謝、糖代謝、應激反應、生長發(fā)育、生物合成、細胞骨架形成、氧化還原和免疫調節(jié)等過程；其中AKAP13-like、FcγBP、MUC5AC-like、MUC、MUC5B 等15 個高表達的蛋白質可作為哈蟆油區(qū)別于青蛙油的重要蛋白質，同時哈蟆油的特異性膨脹度可能與含量較高的黏蛋白類密切相關，本文的研究結果為進一步研究哈蟆油的功效成分奠定基礎。