何天文 區(qū)惠紅 盧建 陳創(chuàng)奇 劉頓 丁紅珂 劉玲 杜麗 尹愛(ài)華★

Meckel 綜合征（meckel syndrome，MS）是由德國(guó)解剖學(xué)家Meckel 等在1822年首次報(bào)道的一種罕見(jiàn)的致死性常染色體隱性遺傳病，臨床上以枕部腦膨出、嚴(yán)重的多囊腎和軸后多指（趾）畸形等為主要特征［1-2］。Meckel 綜合征預(yù)后差，胎兒常發(fā)生宮內(nèi)死亡，出生的胎兒大多僅能存活數(shù)天至數(shù)周，且目前還無(wú)根治的方法，植入前遺傳學(xué)檢測(cè)和產(chǎn)前診斷是預(yù)防Meckel 綜合征患兒出生的有效方法。近年來(lái)，二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)飛速發(fā)展，已經(jīng)成為胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplataion genetic testing，PGT）的主要檢測(cè)手段之一［3］。NGS 能檢測(cè)染色體非整倍性、染色體結(jié)構(gòu)異常和單基因遺傳病，準(zhǔn)確性好且精度高［4-5］。本研究運(yùn)用NGS 對(duì)胚胎MKS1基因突變直接測(cè)序和構(gòu)建胚胎單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）單倍型進(jìn)行PGT，以期避免妊娠Meckel 綜合征和非整倍體胎兒?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

男方（Ⅱ：1），35 歲，表型正常，既往體健。男方父母（Ⅰ：1 和Ⅰ：2）表型正常，既往體健。女方（Ⅱ：2），34 歲，表型正常，既往體健，懷孕2 次，生產(chǎn)0 次，流產(chǎn)2 次，2014年孕25 周時(shí)超聲發(fā)現(xiàn)羊水過(guò)少行引產(chǎn)術(shù)，未進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)；2016年孕19 周時(shí)超聲提示胎兒（Ⅲ：1）枕骨缺如、腦膨出、心包積液、三尖瓣反流、肝回聲增粗、雙側(cè)多囊腎、左側(cè)脛骨骨折、雙足軸前多趾等多種畸形，在外院行引產(chǎn)術(shù)，外院芯片捕獲高通量測(cè)序結(jié)果顯示胎兒MKS1基因c.472C＞T 純合突變，該突變?cè)跀?shù)據(jù)庫(kù)中有疾病相關(guān)性報(bào)道［6］。女方父母（Ⅰ∶3 和Ⅰ∶4）表型正常，既往體?。▓D1）。為了再次避免妊娠患兒，該夫婦于2017年5月在廣東省婦幼保健院就診咨詢要求行PGT。該夫婦充分了解PGT 過(guò)程及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)后，簽署知情同意書(shū)接受PGT。本研究經(jīng)廣東省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

圖1 Meckel 綜合征家系圖Figure 1 Pedigree of Meckel syndrome

1.2 主要試劑與儀器

磁珠法血液基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司），微量樣本全基因組擴(kuò)增（MDA 法）試劑盒（北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司），胚胎植入前單基因病檢測(cè)建庫(kù)試劑盒（北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司），測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒、胚胎植入前單基因病檢測(cè)標(biāo)簽接頭試劑盒（北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司），胚胎植入前染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司），QUBIT 1X 雙鏈DNA 高靈敏度分析試劑盒（北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司），核酸定量計(jì)Qubit Fluorometer（Invitrogen 公司，美國(guó)），verity 梯度PCR 儀、ABI3730 測(cè)序儀（ABI 公司，美國(guó)），MiSeq 高通量測(cè)序儀（Illumina 公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及基因組DNA 提取

分別抽取夫婦（Ⅱ：1 和Ⅱ：2）及雙方父母（Ⅰ：1、Ⅰ：2、Ⅰ：3 和Ⅰ：4）外周血各2 mL，EDTA 抗凝。Ⅱ：2 孕18～24 周時(shí)在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)抽取胎兒羊水5～10 mL。磁珠法血液基因組提取試劑盒提取外周血基因組DNA，Qiamp DNA Blood Mini Kit 提取試劑盒提取羊水基因組DNA，均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.2 Sanger 測(cè)序調(diào)查家系成員MKS1基因突變情況

用Oligo6 設(shè)計(jì)針對(duì)MKS1基因c.472C＞T 突變位點(diǎn)的特異性PCR擴(kuò)增引物（F：5′-TCTACCAAGCACACTAACCC-3′，R：5′-TCCCTCTCTCTGAGGCAC-3′，擴(kuò)增片段位于chr17：56291905-56292495，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為591 bp），PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3730 遺傳分析儀進(jìn)行序列測(cè)定。用SeqMan軟件對(duì)ABI3730 遺傳分析儀生成的ab1 測(cè)序結(jié)果文件進(jìn)行分析，調(diào)查家系成員攜帶MKS1基因c.472C＞T 突變情況。

1.3.3 家系成員單倍型的構(gòu)建

以MKS1基因（NM_017777.3 chr17：56282797-56296966）反向轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)為目標(biāo)，在該基因上下游2 M 區(qū)域內(nèi)（chr17：54576882-58218653）選擇200 個(gè)SNP 位點(diǎn)作為遺傳連鎖標(biāo)記，利用ION AMPLISEQTM DESIGNER 網(wǎng)站設(shè)計(jì)多重PCR 引物，對(duì)提取的家系成員的基因組DNA 進(jìn)行多重PCR，多重PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化和建庫(kù)后行NGS，選擇有效SNP 位點(diǎn)進(jìn)行構(gòu)建家系成員的SNP 單倍型進(jìn)行連鎖分析，確定攜帶MKS1基因c.472C＞T 突變的風(fēng)險(xiǎn)染色體。

1.3.4 胚胎活檢

根據(jù)常規(guī)體外培養(yǎng)方法［6］，首先采用卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）方式進(jìn)行授精，待胚胎培養(yǎng)至第5/6 天，活檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞2～9 個(gè)進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。

1.3.5 植入前遺傳學(xué)檢測(cè)

對(duì)活檢獲得的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行基于等溫多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification，MDA）技術(shù)的全基因組擴(kuò)增（Whole genome amplification，WGA）。利用WGA 產(chǎn)物通過(guò)多重PCR 擴(kuò)增胚胎MKS1基因編碼區(qū)和高密度緊密連鎖的SNP 位點(diǎn)，多重PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化和建庫(kù)后進(jìn)行NGS。通過(guò)NGS 對(duì)胚胎MKS1基因突變位點(diǎn)直接測(cè)序和構(gòu)建胚胎SNP 位點(diǎn)單倍型連鎖分析。通過(guò)Sanger 測(cè)序檢測(cè)MKS1基因c.472C＞T 突變驗(yàn)證二代測(cè)序結(jié)果。針對(duì)正常和雜合攜帶致病突變的胚胎進(jìn)行了低深度的染色體非整倍性篩查，以排除有攜帶染色體拷貝數(shù)異常的胚胎。

1.3.6 產(chǎn)前診斷

于孕18～24 周時(shí)行羊膜腔穿刺進(jìn)行胎兒染色體核型G 顯帶分析和Sanger 測(cè)序檢測(cè)胎兒MKS1基因c.472C＞T 突變，驗(yàn)證PGT 結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 家系成員攜帶MKS1 基因c.472C＞T 突變情況

通過(guò)Sanger 測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該家系成員中男方（Ⅱ：1）、女方（Ⅱ：2）、男方父親（Ⅰ：1）和女方母親（Ⅰ：4）攜帶MKS1基因c.472C＞T 的致病性突變（圖2）。引產(chǎn)胎兒（Ⅲ：1）外院結(jié)果顯示MKS1基因c.472C＞T 純合突變，分別遺傳自父親和母親（圖1）。

圖2 MKS1 基因c.472C＞T 突變Sanger 測(cè)序圖Figure 2 Sanger sequencing of c.472C ＞T mutation in MKS1 gene

2.2 家系成員SNP 單倍型構(gòu)建

經(jīng)過(guò)多重PCR 和NGS 后，選擇了74 個(gè)有效SNP 位點(diǎn)成功構(gòu)建家系成員SNP 單倍型，成功確定夫婦的攜帶MKS1基因c.472C＞T 突變的風(fēng)險(xiǎn)染色體。見(jiàn)表1、圖3。

表1 夫婦有效SNP 位點(diǎn)數(shù)和分布Table 1 Number and distribution of effective SNPs in couples

2.3 植入前遺傳學(xué)檢測(cè)

第6 天活檢6 個(gè)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞分別標(biāo)記為D601、D602、D603、D604、D605 和D606。胚胎 的MKS1基因c.472C＞T 突變的NGS 結(jié)果、SNP 單倍型連鎖分析結(jié)果和Sanger 測(cè)序結(jié)果提示6 個(gè)胚胎中D601、D602 和D603 為未檢測(cè)到突變胚胎，D605 和D606 為雜合攜帶胚胎，D604為致病胚胎。D601、D602、D603、D605 和D606低深度的染色體非整倍體篩查結(jié)果顯示D601為非平衡的整倍體胚胎，其它為平衡的整倍體。見(jiàn)圖4、表2。

圖4 胚胎SNP 單倍型分析結(jié)果Figure 4 SNP haplotype analysis results of embryos

表2 胚胎MKS1基因c.472C＞T突變植入前遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果Table 2 PGT results of c.472C＞T mutation in MKS1 gene

2.4 產(chǎn)前診斷

選擇正常且發(fā)育良好的整倍體胚胎（D602）進(jìn)行移植，孕19 周經(jīng)羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示胎兒染色體核型G 顯帶分析未發(fā)現(xiàn)異常，Sanger測(cè)序未檢測(cè)到胎兒MKS1基因c.472C＞T 突變，與PGT 結(jié)果一致，見(jiàn)圖5。孕38 周順產(chǎn)分娩一正常嬰兒，體重2 690 g，健康狀況良好。

圖5 胎兒MKS1 基因c.472C＞T 突變的Sanger 測(cè)序圖Figure 5 Sanger sequencing map of c.472C＞T mutation in fetal MKS1 gene

3 討論

Meckel 綜合征是一種致死性常染色體隱性遺傳?。?］，發(fā)病率各國(guó)報(bào)道不一，以芬蘭最高，約1/9 000 活產(chǎn)嬰［8］，我國(guó)僅見(jiàn)散發(fā)病例報(bào)道［9-10］。Meckel 綜合征的臨床表現(xiàn)比較一致，但是具有遺傳異質(zhì)性［11］。與Meekel 綜合征相關(guān)的基因有多個(gè)，按基因定位發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序分別稱之為Meckel 綜合征1～6 基因。2006年Kytt?l? 等［12］利用基因克隆技術(shù)確定了MKS1基因定位于17q23，基因長(zhǎng)13 869 bp，包含18 個(gè)外顯子。本研究家系中引產(chǎn)胎兒為MKS1基因c.472C＞T 純合突變導(dǎo)致的Meckel 綜合征，通過(guò)PGT 治療后該夫婦分娩一正常嬰兒，也再次驗(yàn)證了MKS1基因c.472C＞T 突變的致病性。

日前，Meckel 綜合征尚無(wú)有效的根治方法，植入前遺傳學(xué)檢測(cè)和產(chǎn)前診斷是預(yù)防Meckel 綜合征患兒出生的主要手段。絨毛活檢、羊水穿刺、臍帶血穿刺傳統(tǒng)的介入性產(chǎn)前診斷術(shù)具有創(chuàng)性，還具有一定流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)［13］。Meckel 綜合征攜帶者夫婦經(jīng)產(chǎn)前診斷后確診胎兒為Meckel 綜合征后，需要選擇終止妊娠，給孕婦帶來(lái)一定的身體傷害和心理負(fù)擔(dān)。對(duì)Meckel 綜合征攜帶者夫婦進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)，在胚胎植入前進(jìn)行遺傳學(xué)分析后選擇正常胚胎進(jìn)行移植，可以避免異常胚胎妊娠的發(fā)生，阻斷Meckel 綜合征在家系中的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)將遺傳病的預(yù)防提前到胚胎階段，與傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可以避免可能的治療性引產(chǎn)給母體帶來(lái)身體和心理的創(chuàng)傷［6］。

隨著基于MDA 技術(shù)的WGA 技術(shù)的發(fā)明，該技術(shù)克服了單細(xì)胞水平基因檢測(cè)DNA 模板量過(guò)少的問(wèn)題，極大地提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，但是WGA 有擴(kuò)增不均勻和等位基因脫扣（allele drop-out，ADO）的風(fēng)險(xiǎn)［14］。NGS 技術(shù)的發(fā)明，實(shí)現(xiàn)了一次性對(duì)上百萬(wàn)條DNA 進(jìn)行測(cè)序，不僅縮短了耗費(fèi)時(shí)間，也將單堿基測(cè)序成本降至了最低，遺傳性疾病的診斷率和分辨率邁入新的高度，給PGT 技術(shù)帶來(lái)了革命性的改變［6］。NGS 具有高通量、高并行性和高分辨率等特性，二代測(cè)序技術(shù)可以提供高深度的多位點(diǎn)多基因分析，結(jié)合SNP 單倍型連鎖分析，可以避免由ADO 帶來(lái)的檢測(cè)錯(cuò)誤［15］。NGS 已經(jīng)成為PGT 的主要的檢測(cè)手段，其不但能檢測(cè)染色體非整倍性、染色體結(jié)構(gòu)異常和單基因遺傳病，而且準(zhǔn)確性好和精度高，與如熒光原位雜交和比較基因組雜交等傳統(tǒng)的PGT 技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

本研究成功應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)遺傳性Meckel 綜合征家系進(jìn)行植入前遺傳學(xué)檢測(cè)，可以阻斷該單基因病在該家系中的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，還可以避免選擇非整倍體胚胎而導(dǎo)致的流產(chǎn)問(wèn)題，是Meckel 綜合征出生缺陷的有效預(yù)防手段。