付王威，吳睿婷，萬(wàn)敏，李睿城，初悅雷，吳瓊琳，李文娟

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047）（2.南昌大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330031）

糖尿病是一種以高血糖為病癥的慢性代謝性疾病，伴有糖、脂、蛋白及電解質(zhì)紊亂[1]。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2019年世界成年糖尿病患病率高達(dá)9.3%，患者約4.38億人，其中中國(guó)患者最多，約1.16億人，預(yù)計(jì)到2045年，世界成年患者將攀升至7億人[2]。當(dāng)前，臨床上確診的糖尿病主要為Ⅱ型糖尿病，約占患者總數(shù)的90%[3]。研究已證實(shí)長(zhǎng)期高濃度血糖可引起機(jī)體腦、心、腎、眼球、血管等多處器官的損傷和病變，各種并發(fā)癥多達(dá)100多種[4]，嚴(yán)重影響了人類的生理健康和生活質(zhì)量[5,6]。

傳統(tǒng)飲食講究“五谷宜為養(yǎng)，失豆則不良”。白扁豆是中國(guó)的傳統(tǒng)食物，又稱藊豆、白藊豆和南扁豆，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[7]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)白扁豆具有降血糖降血脂的作用，可作為糖尿病人飲食的優(yōu)先選用食物之一[8,9]。多糖是一類通過(guò)醛糖或酮糖，以糖苷鍵連接在一起的高分子多聚化合物，在此基礎(chǔ)上，非淀粉多糖被定義為不含淀粉組分的、通過(guò)在大腸中完全或部分發(fā)酵而被機(jī)體利用的復(fù)合多糖[10]。徐思綺[11]等以黑木耳非淀粉多糖為研究對(duì)象，證實(shí)了該非淀粉多糖具有降血糖作用，為非淀粉多糖的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。目前，豆類多糖生物學(xué)活性方面的研究報(bào)道較多，在糖尿病防治領(lǐng)域被廣泛研究[12]，然而非淀粉多糖的降血糖降血脂作用研究較少，且有關(guān)白扁豆來(lái)源非淀粉多糖的研究尚未見報(bào)道。團(tuán)隊(duì)前期從白扁豆成熟種子中提取純化出一種非淀粉多糖（Non-starch polysaccharide from dolichos lablab L，NS-DLP），平均分子量約為2.3×105u，由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖酸、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，具備良好的抗氧化功能[13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖高脂飲食結(jié)合STZ尾靜脈注射建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，觀察和研究NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿大鼠的影響，以期為白扁豆資源的綜合利用和多糖功能性產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)Wistar大鼠，體重180~220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。

白扁豆，安徽濟(jì)順中藥飲片有限公司；鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），美國(guó)Sigma公司；血糖試紙，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；INS測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）測(cè)定試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；大鼠白介素 6（Interleukin-6，IL-6）測(cè)定試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）測(cè)定試劑盒，博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；Dimension RXLMAX型全自動(dòng)生化分析儀，德靈診斷產(chǎn)品有限公司；3K15高速臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó) Sigma公司；3001全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀（多功能酶標(biāo)儀），美國(guó)Thermo公司；KZ-II組織破碎儀，武漢塞維爾生物科技有限公司；AL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 白扁豆非淀粉多糖（NS-DLP）的提取制備

參照?qǐng)F(tuán)隊(duì)前期發(fā)表文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)方法制備NS-DLP[14]。將白扁豆實(shí)體進(jìn)行粉碎后，加入 95%乙醇溶液，室溫浸泡過(guò)夜，過(guò)濾液體；濾渣加入蒸餾水，100 ℃下蒸煮5 h，過(guò)濾；依次進(jìn)行淀粉酶、蛋白酶、糖化酶除雜，高溫滅活后過(guò)濾、濃縮；加入95%乙醇溶液，4 ℃下沉淀多糖；醇沉后，4000×g離心10 min，加水復(fù)溶，Sevage法去除游離蛋白質(zhì)，旋蒸、透析、濃縮、凍干。

1.3.2 Ⅱ型糖尿病大鼠模型建立

清潔級(jí) Wistar雄性大鼠飼養(yǎng)于清潔衛(wèi)生的環(huán)境（室溫25±2 ℃、相對(duì)濕度50%±5%，晝夜明暗交替12 h/12 h），自由飲食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，選取6只大鼠作為正常組（Control組），喂以基礎(chǔ)飼料，24只大鼠作為實(shí)驗(yàn)組，喂以高糖高脂飼料（66.5%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1%膽酸鈉)[15]。8周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠禁食12 h，尾靜脈注射30 mg/kg bw STZ（溶解在0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，pH為4.4），Control組大鼠注射同等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。一周后測(cè)定空腹血糖（Fasting blood-glucose, FBG），F(xiàn)BG連續(xù)兩次超過(guò)11.1 mmol/L即造模成功[16]。

1.3.3 動(dòng)物分組及處理

將Ⅱ型糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組：模型組（STZ組）、NS-DLP低劑量組（LD組，NS-DLP 25 mg/kg bw）、中劑量組（MD組，NS-DLP 50 mg/kg bw）、高劑量組（HD組，NS-DLP 100 mg/kg bw），每組6只，將 NS-DLP溶于超純水中，每日灌胃一次，Control組和STZ組給予同等劑量超純水。4周后，所有大鼠禁食12 h，進(jìn)行眼底靜脈取血、處死、解剖，收集胰腺組織備用。

而在化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中加入信息化的技術(shù)，把既能夠減少化學(xué)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的環(huán)境污染，又能夠滿足學(xué)生的教學(xué)要求，讓學(xué)生深刻理解化學(xué)反應(yīng)過(guò)程的進(jìn)行.

1.3.4 血清指標(biāo)測(cè)定

血液靜置2 h后，4 ℃ 3500 r/min 離心10 min，收集血清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)FBG、血清總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；采用胰島素（Insulin，INS）試劑盒測(cè)定血清INS水平。

1.3.5 胰腺組織病理切片觀察

采用預(yù)冷的生理鹽水洗去胰腺表面的血漬，濾紙拭干，剔除脂肪。取部分胰腺組織固定于10%福爾馬林溶液中，進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色等處理，利用光學(xué)顯微鏡觀察胰腺組織胰島區(qū)域的病理學(xué)變化并拍照。

1.3.6 胰腺組織炎癥因子指標(biāo)測(cè)定

取部分胰腺組織，以1:9的比例加入生理鹽水，60 Hz低溫勻漿1 min，4 ℃ 5000 r/min 離心15 min，取上清液。嚴(yán)格按照IL-6和TNF-α測(cè)定試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)勻漿液中IL-6和TNF-α的含量。

1.3.7 胰腺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

取部分胰腺組織，以1:9的比例加入生理鹽水，60 Hz低溫勻漿1 min，4 ℃ 5000 r/min 離心15 min，取上清液。嚴(yán)格按照SOD、CAT和MDA測(cè)定試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)勻漿液中SOD、CAT的活性與MDA含量，并使用 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)勻漿液中蛋白質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與討論

2.1 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血清 FBG的影響

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)FBG指標(biāo)評(píng)價(jià)NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血糖的影響，各組FBG水平如圖1所示。與Control組大鼠 FBG水平相比（4.37 mmol/L），STZ組大鼠 FBG水平（29.05 mmol/L）極顯著上升（p<0.01）；進(jìn)行NS-DLP處理4周后，LD和MD組大鼠FBG水平顯著下降（p<0.05），HD組大鼠FBG水平極顯著下降（p<0.01），下降幅度分別為8.60%、8.87%和10.36%。王彤[17]等以饅頭作為標(biāo)準(zhǔn)參照食物，觀察了Ⅱ型糖尿病患者進(jìn)食不同干豆后的血糖變化，結(jié)果顯示進(jìn)食白扁豆血糖指數(shù)得到了顯著降低。與大多數(shù)天然多糖[18,19]研究結(jié)果相似，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠具有一定的降血糖作用。

圖1 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠FBG的影響Fig.1 The effect of NS-DLP on FBG levels of type Ⅱ diabetic rats

2.2 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血脂水平的影響

大量研究已證實(shí)，高血脂與Ⅱ型糖尿病息息相關(guān)：一方面高濃度的血脂可與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入細(xì)胞代謝，阻礙葡萄糖的氧化利用；另一方面高血脂可促使游離脂肪酸大量生成，游離脂肪酸不僅會(huì)干擾INS與其受體結(jié)合，而且能夠直接破壞胰島細(xì)胞的分泌功能，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡[20,21]。Nie[22]研究報(bào)道，車前子多糖可顯著降低Ⅱ型糖尿病大鼠血清的TC、TG水平，提高HDL-C水平，部分改善LDL-C水平，進(jìn)而緩解大鼠的脂代謝紊亂。邵紅亮等[23]研究發(fā)現(xiàn)灌胃6周100 mg/kg bw紅芪多糖，可將Ⅱ型糖尿病大鼠血清TC、TG和LDL-C水平分別降低8.11%、14.46%、14.58%，HDL-C水平提高17.02%。本實(shí)驗(yàn)研究得到了類似的結(jié)果，如圖2，Control組大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C濃度分別為1.70、0.95、1.51和0.41 mmol/L。與Control組相比，STZ組大鼠血清TC、TG和LDL-C濃度分別極顯著升高至 3.46、7.09、1.05 mmol/L（p<0.01），HDL-C濃度顯著降低至 1.25 mmol/L（p<0.05），而灌胃給予NS-DLP可不同程度地改善該癥狀，其中，各組大鼠血清TC和LDL-C水平均下降，但結(jié)果無(wú)顯著性差異，其原因可能在于多糖灌胃周期不夠長(zhǎng)，NS-DLP降TC和LDL-C作用尚未完全凸顯；LD組大鼠血清 TG濃度顯著降低至 5.29 mmol/L（p<0.05）；MD 組大鼠血清 TG 濃度極顯著降低至4.90 mmol/L，HDL-C濃度極顯著提升至1.65 mmol/L（p<0.01）；HD組大鼠血清 TG濃度顯著降低 4.97 mmol/L（p<0.05），HDL-C 濃度極顯著提升 1.61 mmol/L（p<0.01）。上述結(jié)果表明 NS-DLP可改善Ⅱ型糖尿病大鼠的血脂水平，其效果主要體現(xiàn)在降低TG水平和提高HDL-C水平，值得注意的是MD組大鼠指標(biāo)略優(yōu)于HD組，顯示NS-DLP在機(jī)體內(nèi)的有效作用與劑量之間沒(méi)有呈現(xiàn)預(yù)期的正相關(guān)依賴關(guān)系，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)（大部分情況下，HD組大鼠指標(biāo)均優(yōu)于MD組大鼠），提示了NS-DLP體內(nèi)作用模式較為復(fù)雜。

圖2 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血脂水平的影響Fig.2 The effect of NS-DLP on blood lipids levels of type Ⅱdiabetic rats

2.3 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)的影響

STZ作為一種廣譜抗菌素，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的損傷作用，在糖尿病動(dòng)物模型建立中被廣泛應(yīng)用。其誘導(dǎo)糖尿病的機(jī)制可能是通過(guò)亞硝基脲產(chǎn)生自由基對(duì)胰島β細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致胰腺組織病變和胰島萎縮，從而誘發(fā)糖尿病[24]。與Li等[25]和Zhang等[26]試驗(yàn)結(jié)果相似，各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)變化如圖3所示，Control組大鼠胰腺胰島組織結(jié)構(gòu)完整，近似橢圓，邊界清晰圓潤(rùn)，細(xì)胞分布均勻、排列整齊。STZ組大鼠胰島組織嚴(yán)重萎縮變形，邊界不規(guī)則、模糊不清，細(xì)胞空泡變性。LD組、MD組和HD組較STZ組大鼠胰島組織損傷有明顯的改善，其中HD組效果最佳，胰島面積顯著增大，結(jié)構(gòu)趨向完整，邊界清晰，細(xì)胞數(shù)目增多。上述結(jié)果表明NS-DLP可減輕Ⅱ型糖尿病大鼠胰島組織病理性病變，對(duì)維系胰腺正常組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，提示NS-DLP的降血糖降血脂作用與其對(duì)胰腺保護(hù)作用有關(guān)。

圖3 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺形態(tài)的影響（×400）Fig.3 The effect of NS-DLP on the morphology of pancreas of type Ⅱ diabetic rats (×400)

2.4 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血清INS水平的影響

胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）和INS分泌障礙是Ⅱ型糖尿病重要病理機(jī)制之一，不僅是其發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素，而且貫穿于整個(gè)病情的發(fā)展。發(fā)病初期，患者出現(xiàn)IR，INS生物效應(yīng)降低，此時(shí)機(jī)體會(huì)代償性分泌更多的INS以維持血糖平衡[27]，但隨著病情的發(fā)展，患者胰腺組織和胰島功能逐漸病變，最終出現(xiàn)INS分泌障礙，導(dǎo)致FBS驟升[28]。胡吉蕾等[29]研究報(bào)道，趕黃草水提物可提高Ⅱ型糖尿病大鼠INS的葡萄糖吸收率和利用率，將INS水平顯著降低15.78%（p<0.01）。本實(shí)驗(yàn)得到了相似的結(jié)果，由圖4可知，Control組大鼠血清胰島素含量為106.97 mIU/L，STZ組為178.03 mIU/L，上升幅度為 66.43%，結(jié)果具有極顯著性（p<0.01），而灌胃給予NS-DLP均可降低糖尿病大鼠血清INS水平，其中HD組大鼠下降幅度達(dá)到26.36%，效果最優(yōu)，結(jié)果具有顯著性差異（p<0.05）。上述結(jié)果表明NS-DLP可降低Ⅱ型糖尿病大鼠血清INS水平，改善IR程度。

圖4 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血清胰島素水平的影響Fig.4 The effect of NS-DLP on serum INS levels of type Ⅱdiabetic rats

2.5 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺炎癥因子水平的影響

炎癥與糖尿病胰腺功能紊亂的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，炎癥因子在Ⅱ型糖尿病患者胰腺中過(guò)量產(chǎn)生，引起胰島β細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致胰島素分泌失調(diào)。IL-6、TNF-α均為重要的炎癥介質(zhì)，對(duì)胰腺組織具有直接的損傷作用[30]，同時(shí)可加重脂肪、肌肉、肝臟等器官的IR，常作為胰腺炎嚴(yán)重程度的診斷指標(biāo)[31]。沈蒙等[32]報(bào)道了灌胃黑豆皮可溶性膳食纖維可顯著降低Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺TNF-α等炎癥因子的水平，從而發(fā)揮胰腺保護(hù)作用。本研究得到了類似的結(jié)果，如圖5所示，與 Control組相比，STZ組大鼠胰腺中 IL-6和TNF-α水平分別極顯著升高了 79.93%和 67.96%（p<0.01）。與STZ組相比，LD、MD和HD組大鼠胰腺IL-6和TNF-α水平均下降，其中MD組IL-6的結(jié)果具有顯著性差異，下降幅度為28.39%（p<0.05），HD組IL-6和TNF-α的結(jié)果具有極顯著性差異，下降幅度分別 41.18%和 47.18（p<0.01）。上述結(jié)果表明NS-DLP可顯著降低Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺的炎癥水平。

圖5 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺IL-6、TNF-α水平的影響Fig.5 The effect of NS-DLP on pancreatic IL-6 and TNF-α levels of type Ⅱ diabetic rats

2.6 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺氧化應(yīng)激的影響

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)自由基過(guò)量產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)，具體表現(xiàn)為氧化中間產(chǎn)物大量產(chǎn)生，內(nèi)源性抗氧化劑顯著減少，被認(rèn)為是組織炎癥和損傷的重要機(jī)制[33,34]。Ⅱ型糖尿病患者體內(nèi)普遍存在氧化應(yīng)激，段晉寧等[35]研究顯示糖尿病大鼠的治療作用與莪術(shù)多糖減輕胰腺氧化應(yīng)激水平有關(guān)，中劑量組（500 mg/kg bw）可將Ⅱ型糖尿大鼠胰腺SOD和CAT水平由24.33和13.62 U/mg prot顯著提升至28.03和16.39 U/mg prot，MDA水平由8.39 nmol/mg prot顯著降至7.49 nmol/mg prot。借鑒郎茜等人[36]的研究，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺氧化應(yīng)激的影響，得到了類似的結(jié)果。

如表1所示，與Control相比，STZ組大鼠胰腺中SOD和CAT活力分別降低了7.09%和74.26%，MDA水平升高了 53.33%，結(jié)果具有極顯著性差異（p<0.01），而灌胃給予NS-DLP可不同程度地改善該癥狀，其中低劑量NS-DLP對(duì)MDA水平的作用具有顯著性差異（p<0.05），對(duì)SOD和CAT水平的作用具有極顯著性差異（p<0.01），中、高劑量NS-DLP對(duì)三者的作用均具有極顯著性差異（p<0.01）。上述結(jié)果表明 NS-DLP可提高Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷水平。

表1 NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺M(fèi)DA、SOD、CAT水平的影響Table 1 The effect of NS-DLP on pancreatic MDA, SOD and CAT levels of type Ⅱ diabetic rats

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，NS-DLP對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠具有降血糖降血脂作用，可改善IR水平。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)胰腺組織的病理學(xué)觀察及相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其降血糖降血脂作用機(jī)制與其降低胰島組織損傷和胰腺炎癥水平，提高胰腺抗氧化活力有關(guān)。該結(jié)論可為NS-DLP防治糖尿病的研究提供一定的理論依據(jù)，后續(xù)將繼續(xù)開展NS-DLP降血糖作用相關(guān)信號(hào)通路、代謝組學(xué)、腸道微生物組學(xué)的進(jìn)一步研究，揭示NS-DLP降血糖的內(nèi)在分子機(jī)制，推動(dòng)白扁豆糖尿病膳食產(chǎn)品的研發(fā)。