趙位昆， 魯攀， 呂祥威

(1.桂林醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 綜合科(醫(yī)療保健病區(qū))， 廣西 桂林 541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 廣西 桂林 541001)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是當(dāng)前全球致死率和致殘率主要的因素之一，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅[1].早期的溶栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)等再灌注是治療AMI的主要手段[2]，但阻塞的血管在恢復(fù)血液灌注后能夠?qū)е滦募∪毖?再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI)的發(fā)生與發(fā)展，包括出現(xiàn)短暫的機(jī)械功能障礙、心肌頓抑和再灌注心律失常等病理改變[3-4].因此，更深層次地研究MIRI的作用途徑，對(duì)防治MIRI的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要.凋亡是細(xì)胞的一種主動(dòng)的、程序性死亡方式[5].心肌細(xì)胞凋亡參與多種心血管疾病的病理生理過程，如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟重構(gòu)、心肌纖維化、AMI和MIRI等[6-7].磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化等重要病理生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[8].其中，Akt是PI3K/Akt信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)，通過調(diào)控下游的多種效應(yīng)分子在MIRI中發(fā)揮作用[9].瘦素(leptin, LEP)通過LEP受體在調(diào)控機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)、新陳代謝以及多種內(nèi)分泌功能等方面發(fā)揮重要作用[10-11].研究發(fā)現(xiàn)LEP是調(diào)節(jié)心臟新陳代謝和功能的關(guān)鍵激素之一[12].另有研究證實(shí)LEP能夠?qū)π呐K產(chǎn)生直接的保護(hù)作用進(jìn)而減輕MIRI[13-14].而LEP通過何種途徑對(duì)MIRI起到保護(hù)作用的相關(guān)報(bào)道較少，本文旨在探討LEP預(yù)處理抑制心肌細(xì)胞凋亡改善MIRI的可能的作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LEP購(gòu)自Abcam公司 (Cambridge, UK)；PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、β-tubulin和LY294002購(gòu)自Cell Signaling Technology公司(MA, USA)；2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)、BCA蛋白定量試劑盒和二抗購(gòu)自Beyotime公司 (Changsha, China)；肌鈣蛋白T(cardiac troponin T, cTnT) ELISA試劑盒購(gòu)自Cusabio Biotech Co.公司 (MD, USA).

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量200～230 g.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件(溫度20 ℃～25 ℃，濕度50%～60% 和12 h光照和黑暗交替循環(huán).)下進(jìn)行飼養(yǎng)，并給予潔凈水與飼料.

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和動(dòng)物模型

按隨機(jī)分組法將24只大鼠分為4組：正常組(Sham)、缺血/再灌注組(I/R)、瘦素+缺血/再灌注組(LEP+I/R)和LY(LY294002，LY)+LEP+I/R組.Sham組大鼠行開胸手術(shù)，但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD).I/R組大鼠手術(shù)結(jié)扎LAD造成缺血30 min，隨后松開結(jié)扎線模擬再灌注2 h.LEP+I/R組大鼠在結(jié)扎LAD前30 min經(jīng)尾靜脈注射LEP(50 μg/kg)后構(gòu)建MIRI模型.LY+LEP+I/R組大鼠結(jié)扎LAD前30 min經(jīng)尾靜脈分別注射LY294002(0.3 mg/kg)和LEP(50 μg/kg)，隨后再灌注2 h.

以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)對(duì)大鼠腹腔注射麻醉，隨后接實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物呼吸機(jī)，參數(shù)設(shè)置為：呼吸頻率80～90 次/min、呼吸比為2∶1、潮氣量8～10 mL/kg.清除大鼠胸部毛發(fā)，經(jīng)胸骨左緣第4肋間行開胸術(shù)充分暴露心臟，打開心包，找到LAD并使用6-0縫合線結(jié)扎30 min，然后松開結(jié)扎線模擬再灌注2 h.采用心電圖儀記錄心電圖變化(標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián))，ST段抬高≥0.1 mV同時(shí)伴隨結(jié)扎的血管遠(yuǎn)端供血區(qū)域心肌呈灰白色或者腫脹表明MIRI模型構(gòu)建成功.

1.4 心肌梗死面積分析

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)法檢測(cè)心肌梗死面積.操作如下：模擬再灌注2 h后迅速取出大鼠心臟，用預(yù)先準(zhǔn)備好的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗去血液，隨后放入-20 ℃冰箱保存30 min.將充分冷凍后的心臟標(biāo)本切成3 mm厚并浸泡在TTC染色溶液中，隨后放置在37 ℃溫箱避光孵育30 min.梗死面積判定：白色或者灰白色代表梗死區(qū)域，紅色代表非梗死區(qū)域.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析.

1.5 心肌組織病理學(xué)檢測(cè)

將PBS溶液處理后的大鼠心臟浸泡在體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛中6 h.待心肌組織硬化成形后用石蠟進(jìn)行包埋并切成3 mm厚的切片，常規(guī)HE染色.將隨機(jī)選取的樣品，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化(×400).心肌損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為心肌結(jié)構(gòu)無損傷； 1分為輕度心肌組織間質(zhì)水腫，間隙增寬和區(qū)域壞死； 2分為廣泛的心肌細(xì)胞腫脹和組織間質(zhì)水腫，以及中度的區(qū)域壞死； 3分為嚴(yán)重的小血管破壞和心肌壞死，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，收縮帶形成； 4分為嚴(yán)重的彌漫性心肌壞死和出血，伴有大量小血管破壞和收縮帶形成.

1.6 心肌酶檢測(cè)

使用剪刀將PBS溶液處理后的心臟剪碎，然后使用超聲裝置將心肌組織制成勻漿，在8 500 r/min、4 ℃條件下離心15 min.使用移液器提取上清液，參照ELISA試劑盒操作說明，檢測(cè)cTnT表達(dá)水平.

1.7 心肌組織凋亡檢測(cè)

將PBS溶液處理后的心臟在體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛中浸泡6 h，待心肌組織硬化成形后用石蠟進(jìn)行包埋并切成3 mm厚的切片.TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡程度，其中棕色代表心肌凋亡細(xì)胞核，藍(lán)色表示正常心肌細(xì)胞核.TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核與每個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞核總數(shù)的比率為凋亡指數(shù)，每個(gè)標(biāo)本中的觀察視野選擇放大倍數(shù)為400.使用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析.

1.8 心肌組織蛋白質(zhì)印跡分析

將每個(gè)心臟標(biāo)本取100 mg組織放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%生理鹽水中清洗，隨后放入研磨管中，使用醫(yī)用剪剪碎,加入含有苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)的RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)，在冰上靜置30 min使心肌組織充分裂解，并使用移液器轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中.在12 750 r/min、4 ℃條件下離心15 min.使用BCA法(bicinchoninic acid, BCA)蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)心肌組織蛋白.然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將凝膠中的目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上.室溫下PVDF使用PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3和β-tubulin抗體孵育8 h，隨后使用二抗孵育4 h.使用chemiluminescence system系統(tǒng)(Amersham Pharmacia)進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)與分析.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠MIRI模型的構(gòu)建

如圖1所示，結(jié)扎大鼠LAD導(dǎo)致心肌缺血30 min，期間心電圖ST段顯著升高.隨后再灌注2 h可見ST段下降，與此同時(shí)出現(xiàn)再灌注心律失常(室性期前收縮)，表明MIRI模型建立成功.

2.2 瘦素預(yù)處理能縮小大鼠心肌梗死面積

如圖2所示，與Sham組比較，I/R組大鼠心肌梗死面積顯著升高，LEP預(yù)處理能夠縮小大鼠心肌梗死面積，LY294002能夠逆轉(zhuǎn)這種保護(hù)作用.

圖1 大鼠心肌缺血與再灌注期間的心電圖變化

1)與Sham組比較，P<0.05；2) 與I/R組比較，P<0.05；3) 與LEP+I/R組比較，P<0.05.1) Compared with Sham group, P<0.05; 2) Compared with I/R group, P<0.05; 3) Compared with LEP+I/R group, P<0.05.

2.3 瘦素預(yù)處理減輕大鼠心肌組織病理?yè)p傷

如圖3所示，與Sham組比較，I/R組大鼠心肌組織水腫、組織間隙增寬，同時(shí)伴有炎性細(xì)胞因子浸潤(rùn).LEP預(yù)處理組能夠減輕上述病理變化.LY294002可抵消LEP的保護(hù)作用.

1) 與Sham組比較，P<0.05； 2) 與I/R組比較，P<0.05； 3) 與LEP + I/R組比較，P<0.05.1) Compared with Sham group, P<0.05; 2) Compared with I/R group, P<0.05; 3) Compared with LEP+I/R group, P<0.05.

2.4 瘦素預(yù)處理抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡

(1)瘦素預(yù)處理對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響：與Sham組比較，觀察到I/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡程度顯著升高.這種心肌細(xì)胞凋亡程度在LEP預(yù)處理組下降.與LEP+I/R組比較，LY+LEP+I/R組凋亡程度有所升高.

(2)瘦素預(yù)處理對(duì)大鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)的影響：圖5顯示，與Sham組比較，I/R組凋亡蛋白Bcl-2和Bax比值表達(dá)顯著降低.LEP預(yù)處理組可提高Bcl-2和Bax比值表達(dá)，LY294002能抵消此作用，這種表達(dá)趨勢(shì)與TENUL檢測(cè)結(jié)果相符合.

2.5 瘦素預(yù)處理激活PI3K/Akt信號(hào)通路

圖6顯示，與Sham組比較，I/R組PI3K和Akt磷酸化形式(p-Akt)蛋白表達(dá)降低.與I/R組比較，LEP+I/R組PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)顯著升高，提示LEP對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路具有顯著影響.LY294002能阻斷LEP的這種生物學(xué)作用.

1) 與Sham組比較，P<0.05； 2) 與I/R組比較，P<0.05； 3) 與LEP + I/R組比較，P<0.05.1) Compared with Sham group, P<0.05; 2) Compared with I/R group, P<0.05; 3) Compared with LEP + I/R group, P<0.05.

1) 與Sham組比較，P<0.05； 2) 與I/R組比較，P<0.05； 3) 與LEP + I/R組比較，P<0.05.1) Compared with Sham group, P<0.05; 2) Compared with I/R group, P<0.05; 3) Compared with LEP + I/R group, P<0.05.

1) 與Sham組比較，P<0.05； 2) 與I/R組比較，P<0.05； 3) 與LEP + I/R組比較，P<0.05.1) Compared with Sham group, P<0.05; 2) Compared with I/R group, P<0.05; 3) Compared with LEP + I/R group, P<0.05.

3 討論

目前MIRI是心血管系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)之一，進(jìn)一步探討其可能的潛在機(jī)制以及有效的防治策略具有一定的現(xiàn)實(shí)意義.MIRI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，主要涉及鈣超載、線粒體損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡[15-16].心肌細(xì)胞凋亡是MIRI的主要病理特征，細(xì)胞凋亡的多少?zèng)Q定MIRI的程度，心肌缺血啟動(dòng)心肌細(xì)胞凋亡，再灌注使心肌細(xì)胞凋亡程度進(jìn)一步加重，進(jìn)而引起惡性心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死.研究發(fā)現(xiàn)大約50%的MIRI都與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，心肌細(xì)胞凋亡是MIRI發(fā)生的核心因素[17].因此抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)減輕MIRI損傷意義重大[18-19].在生理和病理?xiàng)l件下，許多基因與細(xì)胞凋亡的調(diào)控有關(guān)，其中Bcl-2、Bax和Caspase-3是反映心肌細(xì)胞凋亡的經(jīng)典指標(biāo).Bcl-2過度表達(dá)能夠減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物的形成，干擾線粒體膜的通透性抑制Caspase的激活，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的功能[20-22].Bax為促凋亡因子，其促凋亡作用與Caspase的釋放有關(guān)[23].研究表明過表達(dá)Bcl-2可明顯改善心功能，減少梗死面積和抑制心肌細(xì)胞凋亡[24]，敲除Bax同樣能夠減少梗死面積并改善心功能[25].另外，Caspase-3不僅是凋亡程序的執(zhí)行者，而且還能剪切心肌細(xì)胞的α-肌動(dòng)蛋白和cTnT，進(jìn)而引起心肌梗死面積的增加和心臟功能的障礙[26-27].PI3K/Akt信號(hào)通路是調(diào)控心肌細(xì)胞生存與死亡的信號(hào)通路之一，其通過抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)細(xì)胞存活，并參與多種器官的缺血/再灌注損傷，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活能夠減輕MIRI[28-30].研究發(fā)現(xiàn)對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，能夠調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞凋亡[31].另有研究證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路同樣通過抑制心肌細(xì)胞凋亡減輕MIRI的發(fā)生[32].

近年來研究表明，LEP作為脂肪細(xì)胞分泌的多肽類激素，對(duì)PI3K/Akt通路的激活具有顯著的生物學(xué)作用，參與機(jī)體生理機(jī)能的調(diào)控[33].研究發(fā)現(xiàn)，PI3K信號(hào)通路在LEP調(diào)控的能量代謝中扮演重要作用[34].前期研究發(fā)現(xiàn)LEP預(yù)處理能夠抑制炎癥反應(yīng)從而減輕小鼠MIRI[35]，但具體作用機(jī)制尚不明確.本實(shí)驗(yàn)以構(gòu)建大鼠MIRI為模型，通過LEP預(yù)處理抑制心肌細(xì)胞凋亡來研究其對(duì)心肌的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討其保護(hù)作用是否與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān).

本實(shí)驗(yàn)觀察到心肌細(xì)胞凋亡參與MIRI，模型組出現(xiàn)再灌注心律失常、心肌梗死面積的增加和心肌損傷，大鼠心肌細(xì)胞凋亡程度顯著升高，這與ZHAI等[36]研究結(jié)果相一致.本實(shí)驗(yàn)經(jīng)LEP預(yù)處理后，心肌梗死面積縮小，心肌組織病理?yè)p傷減輕，cTnT水平降低，Bcl-2/Bax比值表達(dá)升高，Cleaved Caspase-3的表達(dá)降低，心肌細(xì)胞凋亡程度減輕.此外還觀察到LEP預(yù)處理能夠顯著增加PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平，激活PI3K/Akt信號(hào)通路.本研究為進(jìn)一步驗(yàn)證其發(fā)生的可能機(jī)制，在LEP預(yù)處理的基礎(chǔ)上加入PI3K抑制劑LY294002，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌梗死面積的增加，心肌損傷再次出現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡再次升高，Bcl-2表達(dá)的水平明顯的降低，Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯升高，可見Bcl-2與Bax的比值明顯降低，并且阻斷PI3K下游靶點(diǎn)Akt的磷酸化.然而，LEP預(yù)處理如何調(diào)節(jié)Bcl-2或Bax的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡的作用，這仍是值得深入探討.從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中推測(cè)：LEP預(yù)處理可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡來保護(hù)心肌細(xì)胞免受MIRI；LEP預(yù)處理的抗凋亡作用與Bcl-2/Bax比值的上調(diào)有關(guān)；LEP預(yù)處理對(duì)MIRI的抗凋亡作用可能是通過PI3K/Akt介導(dǎo)的途徑來實(shí)現(xiàn)的.

綜上所述，LEP預(yù)處理減輕MIRI以及發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān).本研究結(jié)果為探索MIRI的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為預(yù)防MIRI的發(fā)生與發(fā)展提供了新的策略.

作者貢獻(xiàn)聲明：

趙位昆：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，采集數(shù)據(jù)，撰寫論文；魯攀：統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)；呂祥威：提出研究思路和框架，修改論文.

利益沖突聲明：

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.