陳曉霞, 鄧艷芳, 陳舒婷, 師玲玲，*

(1. 南方醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室, 廣東 廣州 510515； 2. 暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 精神醫(yī)學(xué)科, 廣東 廣州 510630;3. 暨南大學(xué) 粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院, 廣東 廣州 510630)

在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，產(chǎn)生于室管膜層和亞室管膜層的神經(jīng)元需要遷移到特定的大腦區(qū)域發(fā)揮作用.神經(jīng)元的正常遷移對(duì)腦回路的正常發(fā)育以及正常的腦功能活動(dòng)至關(guān)重要[1].神經(jīng)元正常遷移和遷移軌跡是細(xì)胞外因子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控的結(jié)果，由神經(jīng)元遷移異常導(dǎo)致的各種腦回路畸形和功能障礙是多種神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的重要病因，包括癲癇[2]、閱讀障礙[3]和自閉癥譜系障礙[4].臨床腦成像、神經(jīng)病理研究和動(dòng)物模型表明[5-7]，神經(jīng)元遷移異常是自閉癥大腦異常的重要特征，對(duì)神經(jīng)元遷移異常進(jìn)行治療干預(yù)成為自閉癥潛在的治療手段.

相關(guān)研究者通過(guò)提取動(dòng)物原代神經(jīng)元進(jìn)行神經(jīng)元遷移體外研究[8]，但是該模型不能完全模擬人類遺傳背景和反應(yīng)完整神經(jīng)發(fā)育過(guò)程.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[9](induced pluripotent stem cells，iPSC)分化神經(jīng)元模型可以從神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells，NPC)貼壁開(kāi)始監(jiān)控神經(jīng)元生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)，模擬神經(jīng)發(fā)育早期神經(jīng)元遷移情況.然而不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元胞體和突起運(yùn)動(dòng)的研究還未見(jiàn)報(bào)道，不同分化階段神經(jīng)元的動(dòng)力參數(shù)尚未有明確描述.

本研究擬建立人iPSC模型對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)恿M(jìn)行研究，并對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)恿π袨檫M(jìn)行表征，探究不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)對(duì)神經(jīng)元胞體和突起運(yùn)動(dòng)的影響，為自閉癥等神經(jīng)元發(fā)育障礙疾病來(lái)源的iPSC模型的神經(jīng)元?jiǎng)恿ρ芯刻峁﹨⒖?

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和培養(yǎng)條件

人iPSC從人類外周血單核細(xì)胞(periphera blood mononuclear cell，PBMC)重編程誘導(dǎo)而來(lái)，購(gòu)買(mǎi)于廣州中科院健康所.iPSC在一定條件下能誘導(dǎo)成神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)而分化為神經(jīng)元.細(xì)胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2.

1.2 方法

1.2.1 iPSC的培養(yǎng)和誘導(dǎo)

iPSC貼壁生長(zhǎng)在基質(zhì)膠包被過(guò)的六孔板，每日換液，培養(yǎng)液為mTesR.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右傳代至基質(zhì)膠包被過(guò)的12孔板(1∶1)，消化液濃度為0.5 mmol/L EDTA.培養(yǎng)液為N2B27+2i(N2B27培養(yǎng)液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為48.3%的DMEM/F-12、49%的Neurobasal、0.5%的N2、1%的B27、0.5%的Insulin、0.5%的NEAA、0.5%的GlutaMAXTM、0.1%的2-Mercaptoethnol、0.1%的Heparin，2i濃度為5 μmol/L SB431542和Drosomophorim).第0～8天，每隔2 d換一次液(避光).

第8天，將12孔板中的細(xì)胞傳代至基質(zhì)膠包被過(guò)的六孔板中，小槍頭機(jī)械切割傳代，培養(yǎng)液為N2B27.第8～16天，每2 d換一次液.

第16天，將六孔板中的細(xì)胞傳代至T25瓶，大槍頭機(jī)械切割傳代，懸浮培養(yǎng).培養(yǎng)液為N2B27+EGF+bFGF(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為48.3%的DMEM/F-12、49%的Neurobasal、0.5%的N2、1%的B27、質(zhì)量濃度分別為20 μg/L的EGF和20 μg/L的bFGF).待小球長(zhǎng)到足夠大，用Accutase進(jìn)行傳代，消化時(shí)間約為15 min.

1.2.2 神經(jīng)元的感染

神經(jīng)小球傳到第2代，用Accutase將神經(jīng)小球消化為單細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，RFP(吉?jiǎng)P基因，貨號(hào)為GCPL40194，滴度為1.38×106TU/mL)慢病毒進(jìn)行感染(懸浮感染4 μL/250萬(wàn)細(xì)胞)，細(xì)胞感染6 h后，1 000 r/min，5 min離心，棄病毒液，用N2B27+EGF+bFGF重懸，懸浮培養(yǎng).培養(yǎng)2 d后，將感染后的神經(jīng)小球消化為單細(xì)胞，種于基質(zhì)膠+星形膠質(zhì)細(xì)胞包被過(guò)的鋪有玻片的24孔板.培養(yǎng)液為N2B27+BDNF+cAMP(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為48.3%的DMEM/F-12、49%的Neurobasal、0.5%的N2、1%的B27、質(zhì)量濃度為20 μg/L的BDNF、濃度為1 μmol/L的cAMP).收集神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程第5天和第15天的細(xì)胞，用于神經(jīng)元形態(tài)學(xué)和神經(jīng)元?jiǎng)恿Ψ治?

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光

取24孔板中培養(yǎng)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)天數(shù)的細(xì)胞(iPSC、NPC、神經(jīng)元)，PBS洗1遍，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的PFA固定15 min；PBS洗1遍，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的BSA封閉液室溫封閉1 h，一抗稀釋液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%BSA配制)4 ℃孵育過(guò)夜；PBS洗3次，二抗稀釋液室溫避光孵育1.5 h；PBS洗3次；封片，用共聚焦熒光顯微鏡拍照.

1.2.4 細(xì)胞動(dòng)力行為分析

表1 Image J分析得到單個(gè)神經(jīng)元?jiǎng)恿?shù)據(jù)Table 1 Analysis of neuron motility from Image J

2 結(jié)果

2.1 體外神經(jīng)發(fā)育模型的構(gòu)建

通過(guò)Dorsomorphim和SB4315242抑制 SMAD信號(hào)通路使 iPSC(圖1 A)體外定向誘導(dǎo)為NPC及再分化為神經(jīng)元(分別見(jiàn)圖1D，圖1 G).iPSC克隆大部分呈圓形，細(xì)胞緊密排列，邊界清晰，狀態(tài)較好；iPSC體積較小，細(xì)胞核大，細(xì)胞核內(nèi)有1～2個(gè)核仁，核仁清晰，核/質(zhì)比高，符合iPSC典型特征.對(duì)iPSC進(jìn)行免疫熒光鑒定，iPSC OCT4、SSEA4染色為陽(yáng)性(圖1 B、圖1 C)，證明了iPSC具有多項(xiàng)分化潛能；對(duì)NPC進(jìn)行免疫熒光鑒定，NPC SOX2染色為陽(yáng)性(圖1 E)，證明了iPSC成功誘導(dǎo)為NPC；為了更好地標(biāo)記神經(jīng)元的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)，對(duì)NPC進(jìn)行RFP慢病毒感染.圖1 G為NPC貼壁培養(yǎng)到12 d的神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體和突起均有較強(qiáng)的紅色熒光.對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光鑒定，神經(jīng)元MAP2染色為陽(yáng)性(圖1 H)，證明了NPC成功分化為神經(jīng)元，并且MAP2能夠特異標(biāo)記神經(jīng)元樹(shù)突，說(shuō)明神經(jīng)元在培養(yǎng)12d時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)明顯的極化.

2.2 不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元胞體動(dòng)力分析

神經(jīng)元遷移有3個(gè)步驟：生長(zhǎng)錐感知微環(huán)境，神經(jīng)元前緣(leading edges)延伸；細(xì)胞核易位或分裂；后緣(trailing edges)收縮[10].其中細(xì)胞核移位是神經(jīng)元遷移的主導(dǎo)過(guò)程，表現(xiàn)為神經(jīng)元胞體移位.因此本組對(duì)不同發(fā)育時(shí)間神經(jīng)元胞體進(jìn)行動(dòng)力分析.取NPC貼壁分化到第5天的神經(jīng)元(早期)和第15天的神經(jīng)元(中晚期)進(jìn)行神經(jīng)元胞體動(dòng)力分析，記錄0～5 h內(nèi)神經(jīng)元胞體的移位.圖2 A為培養(yǎng)到第5天神經(jīng)元每小時(shí)胞體位置的記錄，圖中箭頭標(biāo)記的神經(jīng)元5 h內(nèi)向左上方運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)距離較長(zhǎng)；圖2 B為培養(yǎng)到第15天神經(jīng)元每小時(shí)胞體位置的記錄，圖中箭頭標(biāo)記的神經(jīng)元5 h內(nèi)向右上方運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)距離較短.使用Image J的手動(dòng)跟蹤插件記錄兩組神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)，得到兩組神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)速度數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示與第15天神經(jīng)元相比，第5天神經(jīng)元胞體5 h內(nèi)運(yùn)動(dòng)速度顯著提高(圖2 C)，運(yùn)動(dòng)方向性沒(méi)有差異(圖2 D)；將兩組細(xì)胞0、1、2、3、4、5每小時(shí)胞體運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)(圖2 E)，在第1小時(shí)，第5天神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)速度顯著提高，而在第2、3、4、5小時(shí)，兩組神經(jīng)元運(yùn)動(dòng)速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.研究結(jié)果表明發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)速度明顯下降.

A：iPSC(×40)；B：iPSC細(xì)胞核表達(dá)OCT4(×20)；C：iPSC細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)SSEA4(×20)； D：NPC(×40)；E-F：NPC表達(dá)SOX2(×20,NPC特異性標(biāo)志物)；G：神經(jīng)元(×20)；H-I：神經(jīng)元表達(dá)MAP2(×20,神經(jīng)元樹(shù)突特異性標(biāo)志物).比例尺：50 μm.

2.3 不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)軌跡分析

為了進(jìn)一步分析不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元的運(yùn)動(dòng)軌跡，本組使用Image J的手動(dòng)跟蹤插件記錄兩組每個(gè)神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)，得到兩組單個(gè)神經(jīng)元5 h內(nèi)胞體坐標(biāo)軸數(shù)據(jù)(表1 XY坐標(biāo)軸).將0 h的XY軸數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為原點(diǎn)(0，0)，得到1、2、3、4、5 h新的坐標(biāo)軸位置，用EXCEL作圖，得到兩組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡圖(n=17).結(jié)果表明總體上第5天神經(jīng)元運(yùn)動(dòng)距離更長(zhǎng)，移動(dòng)方向更加隨機(jī)(圖3)，說(shuō)明發(fā)育早期神經(jīng)元運(yùn)動(dòng)距離更長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)方向更隨機(jī).

A-B：活細(xì)胞工作站分別記錄培養(yǎng)第5天和第15天神經(jīng)元0、1、2、3、4、5 h圖像(×20)，比例尺：20 μm；C：神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)速度(第5天，n=27；第15天，n=41)；D：神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)方向性(第5天，n=27；第15天，n=41)，檢驗(yàn)方法：t檢驗(yàn)；E：神經(jīng)元胞體每小時(shí)運(yùn)動(dòng)速度(n=21).檢驗(yàn)方法：Two-way ANOVA. 1)P<0.001.

圖3 不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)軌跡

2.4 不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元突起動(dòng)力分析

在神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中，通過(guò)生長(zhǎng)錐感知微環(huán)境，神經(jīng)元突起可以沿著特定路線生長(zhǎng)延長(zhǎng)，與靶細(xì)胞或神經(jīng)元的胞體、突起建立突觸聯(lián)系[11].因此本組對(duì)不同發(fā)育時(shí)間神經(jīng)元突起進(jìn)行動(dòng)力分析，主要研究神經(jīng)元突起形成消除和突起生長(zhǎng)坍塌修剪過(guò)程，神經(jīng)元突起形成消除是指經(jīng)元突起數(shù)量的增加和減少；神經(jīng)元突起生長(zhǎng)坍塌修剪是指神經(jīng)元突起長(zhǎng)度增加和減少.

圖4 A和圖4 B為活細(xì)胞工作站分別記錄培養(yǎng)第5天神經(jīng)元和第15天神經(jīng)元0、1、2、3、4、5 h的細(xì)胞圖像和跟蹤圖像；跟蹤圖像中，紅色的是胞體，藍(lán)色的是一級(jí)突起，綠色的是二級(jí)突起.通過(guò)對(duì)兩組神經(jīng)元突起進(jìn)行動(dòng)力分析，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元一級(jí)突起形成和消除速度沒(méi)有區(qū)別(圖4 C-E)；但是與第15天神經(jīng)元相比，第5天神經(jīng)元一級(jí)突起生長(zhǎng)和坍塌修剪速度顯著提高(圖4 F-H)，表明發(fā)育早期神經(jīng)元突起運(yùn)動(dòng)更加活躍，這與發(fā)育早期神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)速度更快相一致.為了探究神經(jīng)元胞體動(dòng)力與神經(jīng)元突起長(zhǎng)度、數(shù)量、胞體面積的聯(lián)系，本組統(tǒng)計(jì)了兩組神經(jīng)元0、1、2、3、4、5 h突起長(zhǎng)度和數(shù)量，胞體面積的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第5天神經(jīng)元突起總長(zhǎng)度明顯降低(圖4 I)，突起總數(shù)量明顯提高(圖4 J)，胞體面積的變化率沒(méi)有差異(圖4 K).

A-B：第5天和第15天神經(jīng)元圖像和標(biāo)記圖(×20)，比例尺：50 μm；C：神經(jīng)元一級(jí)突起形成速度(第5天，n=38；第15天，n=19)；D：神經(jīng)元一級(jí)突起消除速度(第5天，n=20；第15天，n=22)；E：將0 h神經(jīng)元一級(jí)突起數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化為1，得到1、2、3、4、5 h神經(jīng)元一級(jí)突起的形成/消除速度(n=20)，大于1表示形成，小于1表示消除；F：神經(jīng)元一級(jí)突起生長(zhǎng)速度(n=38)；G：神經(jīng)元一級(jí)突起坍塌修剪速度(n=60)；H：將0 h神經(jīng)元一級(jí)突起長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)化為1，得到1、2、3、4、5 h神經(jīng)元一級(jí)突起長(zhǎng)度的生長(zhǎng)/坍塌修剪速度(n=20).大于1表示生長(zhǎng)，小于1表示坍塌修剪；I：突起總長(zhǎng)度(n=20)；J：突起總數(shù)量(n=20)；K：胞體面積變化(n=20). 1)P<0.05， 2)P<0.01，3)P<0.000 1.

3 討論

在早期神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)元正常遷移為突觸連接和功能性神經(jīng)環(huán)路的形成奠定了基礎(chǔ)[12-13].神經(jīng)元遷移異常是許多神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的重要病因[14-16].研究者通過(guò)對(duì)癲癇、自閉癥患者進(jìn)行臨床腦成像和神經(jīng)病理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)癲癇、自閉癥患者腦結(jié)構(gòu)存在神經(jīng)元遷移異常特征，比如：局灶性厚腦回和皮層、腦室周?chē)?、海馬和小腦異位；另外不同研究通過(guò)構(gòu)建自閉癥易感基因敲除小鼠模型[6]，發(fā)現(xiàn)在自閉癥小鼠大腦切片和原代神經(jīng)元中均觀察到神經(jīng)元遷移異常，提示神經(jīng)元遷移的異常調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致自閉癥臨床表型的機(jī)制之一.因此目前迫切需要一個(gè)合適的模型對(duì)神經(jīng)元遷移進(jìn)行研究和干預(yù).相關(guān)研究神經(jīng)元遷移異常的動(dòng)物模型不能完全模擬人類遺傳背景，研究結(jié)果難以直接指導(dǎo)臨床治療；同時(shí)不能很好地模擬胚胎時(shí)期神經(jīng)元遷移情況，難以反映完整神經(jīng)發(fā)育過(guò)程.iPSC的出現(xiàn)很好地解決了這個(gè)問(wèn)題，采用人源iPSC來(lái)源神經(jīng)發(fā)育模型可以模擬人類遺傳背景，同時(shí)克服了成體細(xì)胞無(wú)法再現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育過(guò)程的問(wèn)題. Kathuria等[17]取iPSC分化到48 h神經(jīng)元，通過(guò)活細(xì)胞記錄發(fā)現(xiàn)SHANK3基因突變的神經(jīng)元存在神經(jīng)元?jiǎng)恿Σ蛔?目前已有相關(guān)研究報(bào)道人源性神經(jīng)發(fā)育模型進(jìn)行神經(jīng)元遷移的研究，多數(shù)研究直接選取神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，忽略了神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元?jiǎng)恿Σ町悾煌只A段神經(jīng)元的具體動(dòng)力參數(shù)也尚未有明確描述.本研究小組通過(guò)對(duì)不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行描述，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)元胞體和突起運(yùn)動(dòng)逐漸緩慢，具體表現(xiàn)為發(fā)育早期(第5天)神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)和一級(jí)突起生長(zhǎng)坍塌修剪更活躍，提示如果用iPSC分化神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)恿M(jìn)行研究和干預(yù)，研究選擇的時(shí)間點(diǎn)要在發(fā)育早期.

神經(jīng)元?jiǎng)恿ρ芯坎粌H要關(guān)注胞體動(dòng)力，更要關(guān)注突起的生長(zhǎng)和坍塌修剪過(guò)程、突起長(zhǎng)度與分支數(shù)量.神經(jīng)元遷移首先神經(jīng)元軸突遠(yuǎn)離胞體一端的生長(zhǎng)錐面積增大、感知探索微環(huán)境，胞體向前推移，尾部突起消失[18].神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)是神經(jīng)元遷移的主導(dǎo)過(guò)程，與神經(jīng)發(fā)育神經(jīng)嵴、神經(jīng)管、胚腦和不同腦區(qū)的形成有關(guān)；神經(jīng)元突起運(yùn)動(dòng)與神經(jīng)元感知外界理化環(huán)境，引導(dǎo)神經(jīng)元生長(zhǎng)方向，建立神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)及神經(jīng)環(huán)路有關(guān).本研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育早期(第5天)神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)速度顯著提高，可能與發(fā)育早期神經(jīng)元突起總長(zhǎng)度降低和突起總數(shù)量提高有聯(lián)系.神經(jīng)元胞體的運(yùn)動(dòng)依賴于軸突生長(zhǎng)錐，發(fā)育早期生長(zhǎng)錐面積增大，通過(guò)細(xì)胞骨架中絲狀偽足和板狀偽足的伸長(zhǎng)或回縮來(lái)感知微環(huán)境的變化，決定神經(jīng)元運(yùn)動(dòng)方向[19].

本研究采用人源神經(jīng)發(fā)育模型探索不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元胞體和突起動(dòng)力學(xué)參數(shù)，綜合分析發(fā)育早期和中晚期神經(jīng)元5 h內(nèi)胞體運(yùn)動(dòng)速度及每小時(shí)胞體運(yùn)動(dòng)速度、神經(jīng)元胞體整體運(yùn)動(dòng)軌跡、神經(jīng)元一級(jí)突起形成消除和生長(zhǎng)坍塌修剪速度、神經(jīng)元突起總長(zhǎng)度和數(shù)量等參數(shù)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元胞體運(yùn)動(dòng)和突起生長(zhǎng)坍塌修剪過(guò)程均表現(xiàn)出早期活躍于中晚期，本研究模型對(duì)自閉癥等神經(jīng)發(fā)育障礙疾病神經(jīng)元?jiǎng)恿Ξ惓５脑缙诟深A(yù)和研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

作者貢獻(xiàn)聲明

陳曉霞：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，撰寫(xiě)論文，修改論文；鄧艷芳：統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)；陳舒婷：細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)分析；師玲玲：提出研究思路和框架，就數(shù)據(jù)分析提供建議.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.