鐘少文, 王斌*, 黃帥, 林卓遠, 劉暢, 陳斌偉

(廣州醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 1.骨科, 2.泌尿外科, 廣東 廣州 510260)

前列腺癌(prostatic cancer，PCa)是全球男性最常見的惡性腫瘤之一[1]，也是導致癌癥相關死亡的第5大原因[2]，其特點是骨轉移發(fā)生率高[3]. 骨轉移患者的治療是當前面臨的一大挑戰(zhàn)，越來越多的研究趨向于從傳統(tǒng)中草藥中尋找治療骨轉移的新療法[4-5]. 穿心蓮內酯(andrographolide，ANDRO)是天然植物草本穿心蓮中提取的主要有效成分，目前已知具有抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)、抗腫瘤、治療心腦血管疾病等多種藥理作用[6-7]. 既往研究表明ANDRO對前列腺癌[8-9]、結直腸癌[10]等多種腫瘤具有一定的抑制作用，但目前尚無關于ANDRO是否抑制前列腺癌骨轉移病灶細胞體外遷移、侵襲及黏附能力及其作用機制的報道.本研究利用人源性的前列腺癌骨轉移細胞株PC-3和C4-2B進行相關實驗，研究 ANDRO對PC-3和C4-2B細胞體外增殖、細胞周期、遷移及侵襲等生物學行為的影響，并進一步探討其作用機制可能通過抑制Notch信號通路及腫瘤轉移相關蛋白基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達，為進一步研究及臨床應用提供必要的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人前列腺癌骨轉移細胞株PC-3、C4-2B購自ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，美國)，并存放在液氮中保存.

1.1.2 主要試劑與儀器

ANDRO購自美國Sigma公司. 1640培養(yǎng)基、體積分數(shù)為0.25%胰蛋白酶-EDTA(1×)、胎牛血清、青霉素/鏈霉素購自Gibco 公司. Notch信號分子1(Notch signaling molecule 1, Notch-1)、胞內結構域(Notch intracellular domain, NICD)、hairy 相關轉錄因子1(hairy and enhancer of split-related with YRPW motif1, Hes-1)、基質金屬蛋白酶MMP2、MMP9、ICAM-1、GAPDH(14C10)等抗體均購自CST公司(Cell Signaling Technology).

CO2恒溫培養(yǎng)箱(型號：SERIES 8000 WJ)為美國Thermo 公司產(chǎn)品，酶標儀(型號：TY0608)和凝膠成像系統(tǒng)(型號：Geldoc XR+)為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品，流式細胞儀(型號：MuseTM)為德國Merck KGaA公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

常規(guī)細胞培養(yǎng)，將細胞接種在75 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于37 ℃、體積分數(shù)為 5%的CO2條件下的恒溫箱中，使用的1640培養(yǎng)基中補充有體積分數(shù)為10%胎牛血清，以及含青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(質量濃度為100 mg/mL)的雙抗,取對數(shù)生長期細胞進行實驗.

1.2.2 MTS檢測細胞增殖

將PC-3和C4-2B細胞分別用體積分數(shù)為0.25%胰蛋白酶消化后，離心棄上清，加入培養(yǎng)基重懸細胞，以3×104/mL均勻接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，細胞貼壁后加入濃度為0、2.5、5、10、20、40 μmol/L的ANDRO，每組設5個復孔，48 h后檢測ANDRO作用于PC-3和C4-2B細胞的半抑制濃度(IC50). 然后，將細胞分為IC50藥物濃度干預的ANDRO組和對照組，實驗組中的藥物以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)為溶劑，故對照組中亦加入同濃度的DMSO,分別培養(yǎng)0、1、2、3 d，通過每孔加入MTS試劑10 μL，恒溫箱中孵育3 h，多功能酶標儀檢測各孔的吸光度D(490 nm)，以觀察隨著時間變化，ANDRO對細胞增殖的影響.

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期

將細胞分為含IC50藥物濃度干預的ANDRO組和對照組，PC-3和C4-2B細胞分別按上述實驗分組進行中培養(yǎng)48 h后，用預冷的PBS沖洗兩遍，接著離心后去上清，加入-20 ℃預冷的體積分數(shù)為70%的乙醇溶液固定過夜，24 h后再次離心，棄上清，用預冷PBS沖洗兩遍，去除乙醇的影響，離心，棄上清，加入500 μL RNase/PI染色重懸細胞，4 ℃避光孵育20 min，用流式細胞儀測定細胞周期分布情況.

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移

分別按上述分組將PC-3和C4-2B細胞處理48 h，然后用胰酶消化細胞，重懸，細胞數(shù)量調整為1×106/mL，于Transwell小室的上室接種200 μL細胞懸液，并向Transwell下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，將Transwell板放于恒溫箱中培養(yǎng)24 h.然后輕輕取出Transwell小室，用無菌棉簽仔細擦凈小室膜上細胞，膜下細胞用體積分數(shù)為0.1%的結晶紫染色，在光鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野下的細胞數(shù)，計算平均值.

1.2.5 Transwell檢測細胞侵襲

利用Matrigel 1∶8稀釋液(質量濃度為50 mg/L)，均勻鋪于Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風干. 后續(xù)的步驟同1.2.4的細胞遷移實驗.

1.2.6 纖維連接蛋白檢測細胞黏附

用人纖維連接蛋白鋪被于96孔板中2 h后，BSA孵育30 min封閉特異性結合位點.將上述分組處理48 h后，以胰蛋白酶消化重懸，調整細胞數(shù)至1×105/mL，將200 μL細胞懸液接種在96孔板中37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS洗掉未貼壁細胞，體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定30 min，體積分數(shù)為0.1%的結晶紫染色，顯微鏡下觀察拍照，并計數(shù)5個視野的細胞數(shù)，取平均值.

1.2.7 Western blot檢測細胞相關蛋白表達

將PC-3和C4-2B細胞分別用胰蛋白酶消化重懸后，用完全培養(yǎng)基制成2×105/mL的細胞懸液，均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，24 h細胞貼壁后，用不同藥物濃度的ANDRO處理細胞. 培養(yǎng)48 h后，用預冷的PBS洗滌3次，然后用細胞刮將細胞刮下轉移至15 mL離心管中，設定離心機參數(shù)4 000 r/min，離心10 min，棄上清，每管加入100 μL的蛋白酶抑制劑(VRIPA裂解液∶VPMSF=100∶1)，轉移至1 mL EP管中，于冰上裂解30 min，接著4 ℃離心機12 000 r/min離心10 min，吸取清液，用BCA試劑盒檢測各組總蛋白質含量并使用loading buffer染色，將總蛋白稀釋統(tǒng)一質量濃度，95 ℃ 10 min蛋白變性后分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆? 配置質量分數(shù)為10%的SDS-PAGE分離膠與濃縮膠，加入定量的樣品至泳道(約50 μg). 80 V電泳至樣品過分離膠后轉120 V電泳，接著300 mA、90 min電轉，轉移至PVDF膜上. 體積分數(shù)為5%的BSA室溫搖床封閉90 min，然后用TBST洗膜3次，10 min /次，再加入Notch-1、NICD、Hes-1、MMP2、MMP9、ICAM-1及GAPDH對應的一抗(V一抗∶V抗體稀釋液=1∶1 500)，于4℃孵育過夜，次日搖床1h后TBST洗滌3次，10 min/次，再分別加入對應的辣根過氧化物酶標記的二抗Anti-mouse IgG、Anti-rabbit IgG(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶2 000)，繼續(xù)搖床孵育1 h，用TBST洗滌3次，10 min/次，最后 ECL法顯色曝光. 采用 Image J灰度分析軟件分析條帶灰度值，取目的條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對表達量.

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同濃度的ANDRO對細胞增殖的影響

將不同濃度的ANDRO處理 PC-3和C4-2B細胞48 h后，隨著ANDRO濃度的升高，細胞增殖受到抑制的程度越來越顯著，且呈劑量依賴性. 通過SPSS統(tǒng)計軟件分析，細胞增殖率的IC50均約為15 μmol/L，且與0 μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01, 圖1), 故選15 μmol/L的ANDRO進行后續(xù)實驗.

A：不同濃度ANDRO對PC-3細胞增殖的影響.B：不同濃度ANDRO對C4-2B細胞增殖的影響.1)與0 μmol/L組比較，P<0.01.

2.2 ANDRO處理不同時間對細胞增殖的影響

將濃度為15 μmol/L的ANDRO處理 PC-3和C4-2B細胞，檢測不同時間點(1、2、3 d)對細胞增殖的影響. 結果表明，相比對照組，隨著ANDRO作用時間的延長，PC-3與C4-2B細胞增殖受到的抑制作用越明顯，且給藥2 d、3 d后的抑制作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖2).

A: ANDRO不同時間處理對PC-3細胞增殖的影響. B：ANDRO不同時間處理對C4-2B細胞增殖的影響. 1)與對照組比較，P<0.01.

2.3 ANDRO對細胞周期分布的影響

流式細胞儀結果顯示，ANDRO處理48 h后 PC-3與C4-2B細胞處于G1期比例較對照組增高，S期比例相應下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 表1).

2.4 ANDRO對細胞遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結果顯示，15 μmol/L的ANDRO處理48 h后，PC-3和C4-2B細胞遷移能力受到抑制，其遷移率較對照組均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01， 圖3).

表1 ANDRO干預后PC- 3和C4-2B細胞周期分布

A：ANDRO對PC-3和C4-2B細胞遷移的影響；B：ANDRO作用下PC-3和C4-2B細胞遷移率與對照組對比結果.1)與對照組比較，P<0.01.

2.5 ANDRO對細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結果顯示，15 μmol/L 的ANDRO處理PC-3和C4-2B細胞48 h后，細胞的侵襲能力均明顯受到抑制，其侵襲率較對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖4).

A：ANDRO對PC-3和C4-2B細胞侵襲的影響；B：ANDRO作用下，PC-3和C4-2B細胞侵襲率與對照組對比的結果.1)與對照組比較，P<0.01.

2.6 ANDRO對細胞黏附能力的影響

與對照組相比，ANDRO處理PC-3和C4-2B細胞后，其與細胞外基質之間的黏附能力均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖5).

2.7 ANDRO對Notch信號通路蛋白及腫瘤轉移相關蛋白表達的影響

ANDRO處理PC-3和C4-2B細胞48 h后，相比對照組，ANDRO能顯著抑制PC-3和C4-2B細胞Notch信號通路中Notch-1、 Hes-1和NICD的表達，同時也降低腫瘤轉移相關蛋白MMP2、MMP9和ICAM-1蛋白的表達(P<0.01，圖6)，結果表明，ANDRO可以抑制Notch信號通路活性及抑制腫瘤轉移相關蛋白表達.

A：ANDRO對PC-3和C4-2B細胞黏附的影響；B：ANDRO作用下，PC-3和C4-2B細胞黏附數(shù)與對照組對比的結果.1)與對照組(0 μmol/L)相比較，P<0.01.

A：ANDRO作用下PC-3細胞相關蛋白的表達；B：ANDRO作用下C4-2B細胞相關蛋白的表達.1)與對照組比較，P<0.01.

3 討論

隨著人均壽命的延長及飲食結構的改變，目前我國前列腺癌的病發(fā)率也呈上升趨勢[11-12]. 前列腺癌患者早期可能沒有較為顯著的臨床癥狀，多于體檢時直腸指檢發(fā)現(xiàn)結節(jié)或抽血檢測血清前列腺特異抗原(prostate-specific antigen，PSA)升高時發(fā)現(xiàn)，首診時可有轉移性骨痛，而無下尿路梗阻癥狀，導致確診患者多伴有遠處轉移. 前列腺癌患者的死亡往往不是原發(fā)病灶，而是由于腫瘤的遠處轉移，特別是骨轉移[13]. 目前臨床上治療前列腺癌一般選擇雄激素去除治療為主的姑息治療，但其對晚期骨轉移未能起到很好療效，骨轉移的患者預后差，平均生存時間僅為5～17.5個月[14]. 因此，前列腺癌骨轉移的患者迫切需要更佳的治療方法.

近年來，越來越多的研究主要傾向用靶向藥物對前列腺癌進行治療及預防.ANDRO作為傳統(tǒng)中草藥穿心蓮中提取的有效成分，其在免疫調節(jié)、抗腫瘤等方面具有重要的意義.既往研究表明，ANDRO可以抑制小鼠免疫細胞的體外活化和增殖，抑制細胞周期而發(fā)揮免疫調節(jié)的作用[15]. 在抗腫瘤方面，ANDRO也被報道其可以抑制前列腺癌的體外增殖，郭明偉等[16]證明ANDRO可以抑制前列腺癌PC-3細胞增殖、促進其凋亡，并探討了其可能通過調節(jié)凋亡基因Bcl-2及Bax而發(fā)揮作用；周大磊等[17]發(fā)現(xiàn)ANDRO可以抑制前列腺癌細胞增殖、神經(jīng)內分泌分化. 但目前尚無關于ANDRO抑制前列腺骨轉移病灶細胞的體外遷移、侵襲、細胞黏附能力的研究，以及其作用機制是否涉及Notch信號通路的報道. PC-3和C4-2B細胞系作為目前研究前列腺癌骨轉移最常用的細胞系，因其具有一套完整的發(fā)展模型，已被廣泛應用于研究前列腺癌轉移的分子機制、藥物篩選評價和基因治療等[18]. 本研究通過ANDRO作用于前列腺癌骨轉移細胞株PC-3和C4-2B，探討ANDRO對前列腺癌骨轉移的體外抑制作用及其可能存在的作用機制.

以往研究表明，Notch信號通路對細胞的增殖、凋亡、分化、黏附等方面具備調控作用，但在不同細胞或組織，Notch信號通路發(fā)揮的調控作用有所不同[19-20]. Notch信號通路也是當前國內外研究腫瘤領域的熱點之一，如Akbarzadeh等[21]研究表明DAPT分子可以通過靶向Notch信號通路在卵巢癌中發(fā)揮抗轉移作用；Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫氫酶可通過Notch信號傳導途徑抑制胃癌中的腫瘤生長. 在Notch信號通路中，Notch1為通路的核心蛋白，當Notch信號通路被激活后，Notch1會被γ分泌酶復合體切割，裂解并釋放Notch活性結構域NICD，NICD進入細胞核與DNA結合蛋白CSL(CBFl/Suppresor of Hairless/Lag1)及MAML(mastermind-like)結合成三聚體，以啟動下游基因表達，Hes-1是Notch信號通路下游重要的靶基因[23-24]. 進而本課題組推測，ANDRO在抑制前列腺癌骨轉移體外生物學行為可能通過涉及Notch信號通路的表達.

本研究首先驗證了ANDRO可以抑制前列腺癌骨轉移細胞株PC-3和C4-2B的增殖，其藥物IC50均約為15 μmol/L，且表現(xiàn)出濃度和時間依賴的特性，隨著濃度和時間的延長，ANDRO對PC-3和C4-2B細胞增殖的抑制作用越明顯. 在此基礎上，進一步經(jīng)過細胞遷移、侵襲、黏附等實驗方法，利用IC50藥物濃度的ANDRO作用于PC-3和C4-2B細胞，結果表明，ANDRO對PC-3和C4-2B細胞的遷移、侵襲、細胞黏附能力相比對照組均有較明顯抑制作用.流式檢測細胞周期結果顯示，ANDRO處理48h后 PC-3與C4-2B細胞處于G1期比例較對照組增高，S期比例相應下降，實驗表明ANDRO可調控細胞周期的分布.此外，Notch信號通路相關因子Notch-1、 Hes-1和NICD的蛋白表達明顯下調，ANDRO可能抑制前列腺癌骨轉移細胞中Notch信號通路關鍵蛋白和下游基因的表達，通過降低Notch信號活性，進而抑制PC-3和C4-2B細胞的體外增殖和調控細胞周期分布.

此外，本研究檢測了ANDRO對腫瘤轉移相關蛋白MMP2、MMP9和ICAM-1表達的影響. 研究表明，Notch 信號通路活性下降的會下調基質金屬蛋白酶MMPs，共同抑制腫瘤的體外轉移[25-26]. MMPs是一類鋅依賴性內源性蛋白酶，在組織重塑和細胞外基質各種蛋白質的降解中具有多種作用. 目前已知MMPs可促進細胞增殖、遷移和分化，并在細胞凋亡、血管生成、組織修復和免疫應答中發(fā)揮作用，同時影響細胞表面的生物活性分子并調節(jié)著各種細胞和信號傳導途徑[27-28]. MMP-2及MMP-9是MMPs家族成員之一,MMP-2可以水解細胞外基質相關成分從而使腫瘤細胞對周圍組織具有更強的侵襲能力[29]，MMP-9可以降解細胞外基質并在腫瘤細胞的侵襲轉移過程中發(fā)揮重要作用[30]. 此外，ICAM-1是黏附分子中免疫球蛋白超家族(immunoglobulins superfamily，IGSF)中的一員，在細胞間黏附反應中扮演重要角色[31]. 本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過ANDRO處理后，PC-3和C4-2B細胞的遷移、侵襲以及細胞與外基質的黏附能力均明顯下降，且western blot結果顯示，MMP-2、MMP-9、ICAM-1的蛋白表達水平較對照組下調. 進而推測，ANDRO可能通過抑制Notch信號通路及腫瘤轉移相關蛋白表達，影響前列腺癌骨轉移細胞株的體外增殖、遷移、侵襲和細胞黏附能力.

綜上所述，ANDRO可以抑制前列腺癌骨轉移細胞株的體外增殖、遷移、侵襲和細胞黏附能力，并影響其細胞周期分布，其作用機制可能與ANDRO抑制Notch信號通路蛋白及腫瘤轉移相關蛋白表達有關. 這將為臨床治療前列腺癌骨轉移患者提供理論依據(jù)和新的希望，但ANDRO抑制前列腺癌骨轉移可能涉及多條信號通路，其具體的作用機制和臨床應用仍需更深入地研究探討.

作者貢獻聲明

鐘少文：設計并開展實驗、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；王斌：提出研究思路和框架，修改論文；黃帥：提出研究思路和指導實驗方法，修改論文；林卓遠：指導實驗方法，指導撰寫論文；劉暢：收集整理數(shù)據(jù)；陳斌偉：統(tǒng)計分析數(shù)據(jù).

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.