李鳳華，鄭鳳家，曹艷平，李 蔚，王 林，辛成龍

（山東大學預防醫(yī)學研究院，山東省疾病預防控制中心，山東濟南 250014）

呋喃及甲基呋喃（2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃）是一類無色、易揮發(fā)的小分子化合物，具有麻醉和刺激性，有毒且易燃，吸入后可引起頭痛、頭暈、惡心、呼吸衰竭[1?2]。國際癌癥研究機構(gòu)研究認為，呋喃對人類具有潛在的致癌性，將呋喃歸為2B類致癌物[3?4]。呋喃的檢測和評估一直是國內(nèi)外研究機構(gòu)關注的熱點，美國食品藥品監(jiān)督管理局（US FDA）和歐盟食品安全局（EFSA）等權(quán)威機構(gòu)發(fā)現(xiàn)多種食品中存在呋喃[5?8]。呋喃可由抗壞血酸、氨基酸、碳水化合物、不飽和脂肪酸等前體物質(zhì)產(chǎn)生[9?10]，廣泛存在于咖啡、罐頭等食品中[11?15]。而2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃與呋喃性質(zhì)類似，都可能由食品在熱加工過程中產(chǎn)生，且來源與食物中呋喃的形式相同，對人與動物都具有相似的毒性。

到目前為止，甲基呋喃國內(nèi)研究的較少，有關食品和飲料甚至嬰幼兒食品中的含量信息有限。EFSA在2017年風險評估過程中針對食品中呋喃、2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃四種呋喃類化合物進行評估，但是只得到了呋喃的分析結(jié)果，并未獲得其它三種甲基呋喃的數(shù)據(jù)，專家組經(jīng)過評估發(fā)現(xiàn)，對于嬰兒食品，主要的呋喃暴露途徑為即食食品，由于這類食品大多經(jīng)過高溫處理和密閉封裝，呋喃的含量水平較高[16?18]，而嬰幼兒的食物比較單一，可能為呋喃及甲基呋喃的高暴露人群。因此需要建立合適的方法，收集更多關于食品中呋喃及甲基呋喃類化合物含量的數(shù)據(jù)以便進行人體健康風險的暴露評估。

目前針對呋喃的測定研究比較多，應用的方法主要是電化學分析法[19]、頂空氣相色譜-質(zhì)譜法[20?22]和頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法[23?26]。由于呋喃、甲基呋喃分子量小，易揮發(fā)，定量容易受到基質(zhì)干擾，頂空進樣是分析此類化合物的最合適的方法。本實驗通過優(yōu)化頂空氣相色譜-質(zhì)譜條件，利用頂空裝置將樣品中的目標化合物提取出來，消除基質(zhì)干擾，采用氣相色譜分離，質(zhì)譜定性定量，建立了同時測定嬰幼兒輔助食品中四種呋喃類化合物的方法，并應用本方法對市售嬰幼兒輔食中的四種呋喃類化合物的含量狀況進行了調(diào)查，為食品安全風險評估監(jiān)測研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嬰幼兒輔食 按照國家食品安全風險監(jiān)測標準要求采集市售嬰幼兒輔食樣品共139份，包括26份餅干，10份米粉，13份蛋糕，75份水果泥，15份肉（魚）泥，均為定型包裝樣品；甲醇 色譜純，德國Merck公司；氯化鈉 優(yōu)級純，國藥集團；試驗用水Millipore純水機制取超純水；標準品呋喃（100μg/mL）、D4-呋喃（100μg/ mL）、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃德國Dr.公司；2-甲基呋喃、D3-3-甲基呋喃、D3-2,5-二甲基呋喃 加拿大TRC公司；D6-2-甲基呋喃 加拿大CDN Isotopes公司。

Thermo Trace1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配有EI源、Triplus三合一（液體、頂空、固相微萃?。┳詣舆M樣器，美國Thermo公司；Millipore—Q超純水機 美國Millipore公司；精密移液器 美國Thermo公司；Vortex-Genie2渦旋混勻器 美國Scientific公司；Sartorius CPA225D電子天平 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 餅干和蛋糕樣品放入?20℃冷凍2 h，用食品粉碎機粉碎，?20℃密封冷凍保存并盡快測定，其余樣品在分析前放入4℃冰箱中冷藏過夜。

1.2.2 標準溶液的配制3種甲基呋喃混合標準儲備液的配制：分別稱取2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃標準品適量，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為100μg/mL的混合標準儲備液，0～8℃避光保存。

D6-2-甲基呋喃、D3-3-甲基呋喃、D3-2,5-二甲基呋喃混合同位素內(nèi)標儲備液的配制：分別稱取標準品適量，用甲醇配制成濃度為100μg/ mL的標準儲備液，0～8℃避光保存。

高濃度呋喃及甲基呋喃混合標準使用液的配制：移取呋喃及3種甲基呋喃混合標準儲備液適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成1.0μg/mL的4種混合標準使用液，0～8℃避光保存。

低濃度呋喃及甲基呋喃混合標準使用液的配制：移取高濃度混合標準使用液1.0 mL，加入甲醇稀釋定容至10.0 mL，配制成濃度為0.1μg/mL的混合標準使用液，0～8℃避光保存。

同位素內(nèi)標混合溶液的配制：移取D4-呋喃及甲基呋喃混合同位素內(nèi)標儲備液適量，用甲醇稀釋并定容至50.0 mL，配制成濃度為1.0μg/mL的同位素內(nèi)標混合使用液，0～8℃避光保存。

1.2.3 樣品測定 迅速稱取4℃冷藏過夜的混勻固體樣品1.0 g（精確至0.01 g），罐裝半固體樣品2.50 g（精確至0.01 g）于20 mL頂空瓶中，加入10 mL 20%氯化鈉溶液，加入濃度為1.0μg/mL的4種內(nèi)標混合標準溶液100μL，并立即蓋上頂空瓶蓋子，混勻，放置到頂空進樣裝置上，GC/MS自動進樣分析，結(jié)果以重復性條件下獲得的三次獨立測定結(jié)果的算術平均值計算。

1.2.4 色譜質(zhì)譜條件

1.2.4.1 頂空條件 頂空孵化室平衡溫度60℃，加熱時間30 min；進樣針溫度：70℃。

1.2.4.2 色譜條件 HP-PLOTQ毛細管色譜柱：30 m×0.32 mm（內(nèi)徑）×20μm（膜厚）；進樣口溫度：200℃；程序升溫：初溫60℃，保持1 min，以10℃/min升至230℃，保持2 min；載氣：氦氣，流速：1.7 mL/min；分流進樣，分流比3:1。

1.2.4.3 質(zhì)譜條件 離子源：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲10 min；檢測方式：選擇離子（SIM）掃描。保留時間及監(jiān)測離子參數(shù)見表1。

表1 四種呋喃類化合物及同位素內(nèi)標SIM模式下檢測條件Table 1 Selected ion monitoring (SIM)conditions for the determination of furans

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 線性關系、檢出限與定量限的考察 取8個20 mL頂空進樣瓶，分別加入10 mL 20%氯化鈉溶液，1.0μg/mL 4種內(nèi)標混合應用液100μL，依次加入不同體積的高低濃度的混合標準使用液，制成含1.0、3.0、5.0、10.0、20.0、40.0、100和200 ng的標準系列，GC/MS進樣分析，以不同濃度的各目標物的峰面積與其內(nèi)標峰面積比值對應相應的質(zhì)量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。按照三倍信噪比（3 S/N）計算檢出限，10倍信噪比（10 S/N）為定量限，確定四種呋喃類化合物的檢出限和定量限。

1.2.5.2 加標回收率、精密度試驗 精密稱取已知含量不同種類的嬰幼兒輔食樣品適量，進行回收率和精密度試驗，分別添加三個不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液，按照1.2.3項下方法進行前處理和測定，每個濃度平行測定6次，計算其加標回收率和相對標準偏差，以驗證該方法的準確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用內(nèi)標法進行定量，應用儀器配置工作站Xcalibur系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集處理，并使用excel 2010進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件的優(yōu)化

根據(jù)檢測目標物呋喃及甲基呋喃的特點和色譜柱的性質(zhì)以及查閱文獻，本試驗選擇了HP-PLOTQ色譜柱。將配制好的濃度為1.0μg/mL的單標溶液按照方法進行全掃描采集，確定8個目標物的定性定量離子，并采用選擇離子掃描方式（SIM）分段采集檢測不同保留時間的待測物，以提高樣品檢測的靈敏度并消除部分雜質(zhì)的干擾。通過優(yōu)化色譜分離條件，獲得最優(yōu)的色質(zhì)譜儀器條件。應用已建立的方法，SIM監(jiān)測模式下四種呋喃及同位素內(nèi)標物混合標準溶液的總離子流圖見圖1。

圖1 混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of mixed standardssolution

2.2 頂空條件的優(yōu)化

由于頂空孵育平衡溫度和時間的選擇直接影響樣品中四種呋喃類化合物定量的準確性，本試驗按照方法將四種呋喃類化合物的標準溶液加入頂空瓶中，使得頂空瓶中四種目標化合物的加入量為100 ng，將頂空瓶密封好后分別在40、50、60、70、80℃的溫度下平衡30 min，分析四種目標化合物的峰面積，結(jié)果見圖2a。結(jié)果表明，四種目標化合物在60℃下回收最好，確定選擇樣品的平衡溫度為60℃。

另外將頂空瓶密封好后分別在60℃下平衡15、20、30、40、50 min，分析四種呋喃類化合物的峰面積，發(fā)現(xiàn)平衡時間20～50 min，峰面積沒有明顯的改變，見圖2b。因此選擇樣品的平衡時間為30 min。

圖2 頂空參數(shù)的優(yōu)化Fig.2 Optimization of HS parameters

2.3 無機鹽氯化鈉濃度的選擇

本試驗考察了不加氯化鈉，加入10%氯化鈉和20%氯化鈉對各目標物峰面積的影響，發(fā)現(xiàn)頂空分析中加入氯化鈉，各目標物的峰面積均有成倍的增長，見圖3。且線性關系良好，說明加入氯化鈉可以促進樣品中的目標物進入頂空相，所以本試驗確定加入20%氯化鈉以提高檢測方法的靈敏度。

圖3 無機鹽氯化鈉濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of NaCl concentration

2.4 定量方法的選擇

由于氘代同位素內(nèi)標與目標物有相似的物理化學性質(zhì)，因此在樣品分析的過程中，加入氘代同位素內(nèi)標能校正分析過程中各種因素對待測目標物的影響，提高了檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性。

采用標準加入法和純?nèi)軇藴是€法兩種方法測定嬰幼兒餅干、米粉、蛋糕、水果泥和肉泥中四種呋喃類化合物含量的平均結(jié)果（平行測定三次）見表2。由5種不同基質(zhì)樣品的檢測結(jié)果對比表明標準加入法和純?nèi)軇藴是€法兩種方法沒有顯著性差異，證明兩種定量方法基本等效，為了避免重復樣品操作的繁瑣，提高分析的效率，當分析測定大批量樣品時，推薦采用純?nèi)軇藴是€法定量。

表2 標準加入法和純?nèi)軇藴是€法定量樣品中四種呋喃的檢測平均結(jié)果（n=3）Table 2 Resultsof 4 furansin sampleswith standard addition method and solvent standard curvemethod (n=3)

2.5 工作曲線和檢出限、定量限

以目標物的質(zhì)量為橫坐標，目標物的峰面積與同位素內(nèi)標的峰面積之比為縱坐標繪制工作曲線。結(jié)果表明，各化合物在1～200 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關系，線性回歸方程、相關系數(shù)見表3。以3倍信噪比（3 S/N）和10倍信噪比（10 S/N）計算方法的檢出限和定量限，餅干、米粉、蛋糕稱取1.00 g，4種化合物的檢出限均為0.2μg/kg，定量限為0.5μg/kg；水果泥和肉泥稱取2.5 g，檢出限均為0.1μg/kg，定量限為0.3μg/kg。

表3 線性參數(shù)Table3 Linearity parameters

2.6 精密度與回收率試驗

分別稱取一定質(zhì)量的餅干、米粉、蛋糕、果泥、肉泥樣品，加入不同質(zhì)量濃度混合標準溶液，按照方法處理，使得添加水平相當于樣品中10、40、200 ng，測定不同基底樣品高低濃度的回收率，結(jié)果見表4。不同基底樣品高低濃度的加標回收率為81.6%～110.5%，相對標準偏差（RSD，n=6）為3.44%～14.2%，說明方法具有良好的回收率與精密度。

表4 精密度及回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 4 Results of test for precision and recovery (n=6)

2.7 實際樣品的檢測

利用已建立的方法，采集市售的嬰幼兒輔食樣品共139份，其檢出結(jié)果見表5，所有樣品檢出率最高的是呋喃，為98.6%。肉泥樣品中檢出四種目標物的中位值最大，其中一份餅干樣品中呋喃和2-甲基呋喃的含量最高，分別達到了177.2和313.4μg/kg。

表5 樣品中四種呋喃類化合物的檢測結(jié)果Table5 Detection resultsof 4 furansin 139 samples

3 結(jié)論

本文建立了同位素稀釋-頂空氣相色譜/質(zhì)譜法檢測嬰幼兒輔食中四種呋喃類化合物的檢測方法。通過優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件以及樣品前處理方法，目標化合物得到完全分離，線性關系良好，而且方法操作簡單，靈敏度高，準確、可靠，適用于嬰幼兒輔食樣品中呋喃及甲基呋喃類化合物的檢測，滿足此類樣品污染狀況調(diào)查工作開展的要求，實驗所得數(shù)據(jù)可以為制定食品安全標準和嬰幼兒人群膳食暴露評估提供數(shù)據(jù)支持。