韓鋒，肖宏華*，胡妍文，馬秉智，劉開(kāi)玉（.北京市朝陽(yáng)區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 004；.中日友好醫(yī)院，北京 0009）

潰瘍油為中藥復(fù)方制劑，處方由大黃、白芷、川芎組成，臨床用于熱毒蘊(yùn)結(jié)于肌膚所致的疥瘡、潰瘍等癥，具有活血生肌、消腫止痛的功能?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1-3]，通過(guò)薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別，樣品用量大，提取方法較為繁瑣。目前，針對(duì)該制劑質(zhì)量分析方法的研究報(bào)道較少，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]，采用HPLC-DAD 法建立潰瘍油的特征圖譜，對(duì)該制劑所含多種化學(xué)成分進(jìn)行分析，并對(duì)其中歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚的含量進(jìn)行測(cè)定，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260，DAD 檢測(cè)器，二元泵，ChemStation 工作站）；電子天平（XS-205 DU，十萬(wàn)分之一，METTLER-TOLEDO）；純水/超純水系統(tǒng)（明澈TM-D 24 UV，Merck Millipore）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

藥材大黃（批號(hào)：121249-201304）、川芎（批號(hào)：120918-201612）、白芷（批號(hào)：120945-201510）（中國(guó)食品藥品檢定研究院），對(duì)照品歐前胡素（批號(hào)：110826-201918，含量以99.0%計(jì)）、藁本內(nèi)酯（批號(hào)：111737-201608，含量以86.9%計(jì)）、異歐前胡素（批號(hào)：110827-201611，含量以99.4%計(jì)）、大黃素（批號(hào)：110756-201512，含量以98.7%計(jì)）、大黃酚（批號(hào)：110796-201922，含量以99.4%計(jì)）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（HPLC，F(xiàn)isher Chemical）；磷酸（HPLC，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；超純水（自制）；花生油（批號(hào)：20190923，嘉里糧油青島有限公司）。

按潰瘍油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載的處方與制法制備10 批樣品，處方中大黃、白芷、川芎各10 批均為市售，經(jīng)本中心肖宏華副主任藥師鑒定，符合《中國(guó)藥典》2015年版一部的要求。市售潰瘍油5 批（廠家A：20180403、20191205、20200324、20200401；廠家B：20200106）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇（A）、0.2%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～15 min，60%A；15～25 min，60%～100%A；25～37 min，100%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；光譜范圍：190～400 nm，流速1.0 mL·min－1；步進(jìn)值1.0 nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 分別含歐前胡素51.09 μg、藁本內(nèi)酯82.90 μg、異歐前胡素10.30μg、大黃素10.56 μg、大黃酚21.35 μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取潰瘍油樣品，精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理（500 W，40 kHz）20 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，－18℃冷藏2 h，取上清液用0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 藥材及陰性樣品溶液 按照潰瘍油處方及工藝，制備大黃、白芷、川芎藥材及相應(yīng)的陰性樣品，以及花生油陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備相應(yīng)陰性樣品溶液。

2.3 潰瘍油HPLC 特征圖譜研究

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次。以峰6（歐前胡素）為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.020%～0.080%，相對(duì)峰面積的RSD為0.15%～1.7%，相似度均大于0.99，結(jié)果表明該檢測(cè)系統(tǒng)具有良好的精密度。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一潰瘍油樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰6（歐前胡素）為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.020%～0.11%，相對(duì)峰面積的RSD為0.32%～1.7%，相似度均大于0.99，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰6（歐前胡素）為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.020%～0.23%，相對(duì)峰面積的RSD為0.18%～1.6%，相似度均大于0.99，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 特征圖譜的建立 取10 批潰瘍油，分別進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，將得到的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 版”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算相似度，建立對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖1和圖2。結(jié)果顯示各批圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜之間相似度均大于0.94，見(jiàn)表1。并確定13 個(gè)共有峰，其中峰6（歐前胡素）分離度良好，保留時(shí)間和峰面積適中，且其相對(duì)穩(wěn)定，故選定峰6（歐前胡素）為參照峰（S）。

圖1 對(duì)照HPLC 特征圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of reference

圖2 10 批潰瘍油HPLC 圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of 10 batches of Kuiyang oil

表1 10 批潰瘍油相似度分析結(jié)果Tab 1 Similarity of 10 batches of Kuiyang oil

2.3.5 特征峰的藥味歸屬 取“2.2.3”項(xiàng)下大黃、白芷、川芎藥材溶液及相應(yīng)的陰性樣品溶液，進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，通過(guò)色譜峰保留時(shí)間及DAD 光譜圖對(duì)潰瘍油樣品色譜中的特征峰進(jìn)行藥味歸屬，利用對(duì)照品進(jìn)行成分確認(rèn)。結(jié)果峰1 來(lái)源于輔料花生油，峰2、3、6（歐前胡素）、8、10（異歐前胡素）來(lái)源于白芷，峰4、7（藁本內(nèi)酯）、9來(lái)源于川芎，峰5、11（大黃素）、12（大黃酚）、13 來(lái)源于大黃，見(jiàn)圖3。

2.3.6 樣品測(cè)定 取市售潰瘍油5 批進(jìn)行檢測(cè)，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并通過(guò)與特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和光譜圖比對(duì)，除20180403 樣品（其中2、3、4、7、13 色譜峰低于檢出限）外，各批色譜數(shù)據(jù)與對(duì)照特征圖譜的相似度在0.85 以上，均檢出與對(duì)照特征圖譜相對(duì)應(yīng)的13 個(gè)特征峰，表明本文建立的特征圖譜具有良好的適用性，見(jiàn)圖4。

圖4 5 批市售潰瘍油與對(duì)照HPLC 圖譜Fig 4 HPLC chromatogram of 5 batches of Kuiyang oil and reference

2.4 潰瘍油中5 個(gè)成分的含量測(cè)定

2.4.1 專屬性考察 分別取供試品、對(duì)照品、陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示在供試品色譜中待測(cè)成分與其他成分分離度大于1.5，各陰性樣品色譜中分別在歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚色譜峰相應(yīng)保留時(shí)間處，無(wú)相對(duì)應(yīng)的色譜峰，表明各陰性樣品與待測(cè)成分之間無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖3。通過(guò)色譜數(shù)據(jù)處理軟件（AgilentChemStation）的光譜功能，對(duì)各色譜峰進(jìn)行純度檢測(cè)，純度因子均大于993，供試品中的待測(cè)成分色譜峰的光譜圖與各對(duì)照品色譜峰的光譜圖一致，表明該方法專屬性良好。

圖3 樣品、對(duì)照品、單味藥材、各陰性樣品的HPLC 圖譜Fig 3 HPLC chromatogram of sample，reference substance，single medicinal and negative samples

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液0.4、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。將上述8 個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品混合溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品量（ng）為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系Tab 2 Linearity

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.1%、0.77%、0.93%、1.1%、1.5%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚的峰面積RSD分別為1.0%、1.0%、0.71%、1.7%、1.3%，結(jié)果表明供試品溶液中上述5 個(gè)成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚的含量，RSD分別為2.4%、1.4%、2.9%、2.4%、2.3%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 精密量取混合對(duì)照品溶液5 mL，置具塞錐形瓶中，減壓揮干溶劑，加入已知含量的樣品（批號(hào)：20191205）1 g，混勻，制備6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚的平均加樣回收率（n＝6）分別為94.2%（RSD＝0.86%）、91.0%（RSD＝1.9%）、109.8%（RSD＝1.0%）、102.7%（RSD＝2.8%）、99.2%（RSD＝2.1%），回收率符合要求。

2.4.7 樣品含量測(cè)定 分別取廠家A 潰瘍油4 批及廠家B 潰瘍油1 批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(μg·g－1，n＝3)Tab 3 Samples determination (μg·g－1，n＝3)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

通過(guò)文獻(xiàn)[2-3]可知?dú)W前胡素、異歐前胡素為白芷的有效指標(biāo)成分，藁本內(nèi)酯為川芎的有效指標(biāo)成分，大黃素、大黃酚為大黃的有效指標(biāo)成分，均具有專屬性，故對(duì)潰瘍油中上述5 種成分進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.2 色譜條件的選擇

通過(guò)文獻(xiàn)[7-10]分析，選擇乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液等作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，并進(jìn)行了比例優(yōu)化，結(jié)果表明甲醇-0.2%磷酸溶液作為流動(dòng)相通過(guò)梯度洗脫，所得色譜峰峰形較好，保留時(shí)間和峰面積較穩(wěn)定。通過(guò)光譜分析，各成分最大吸收波長(zhǎng)分別為歐前胡素（248、302 nm）、藁本內(nèi)酯（280、330 nm）、異歐前胡素（250、312 nm）、大黃素（290 nm，并在240～280 nm 處有寬幅吸收）、大黃酚（257 nm），以上5 個(gè)成分均在254 nm 處有較大的紫外吸收，且基線平穩(wěn)，無(wú)其他成分干擾?？疾炝薟aters XBridge、Waters Sunfire 與Phenomenex C18色譜柱及柱溫（30、35、40 ℃），結(jié)果表明Waters XBridge C18色譜柱，柱溫40℃的分離效果最好。

3.3 提取方法的選擇

考察了乙腈、甲醇作為提取溶劑，在相同條件下所得檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，從溶劑的性質(zhì)及成本考慮，最終選擇甲醇作為提取溶劑?？疾炝嘶亓魈崛『统曁崛?，在相同條件下檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，從操作簡(jiǎn)便考慮，最終選擇超聲提取。并對(duì)提取時(shí)間（15、20、40、60 min）、溶劑用量（10、20、25 mL）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明溶劑用量20 mL、超聲提取20 min 為最優(yōu)提取條件。

3.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

市售5 批樣品中，各批次間的峰面積有一定差異（RSD為16.0%～48.9%），反映出各化學(xué)成分含量的差異性。這些差異可能來(lái)自于原料，也可能是貯存條件造成的。樣品20180403 的圖譜中，變化較大的4 號(hào)峰和7 號(hào)峰均來(lái)自于川芎，其中7 號(hào)峰對(duì)應(yīng)的藁本內(nèi)酯變化最大。對(duì)藁本內(nèi)酯的穩(wěn)定性研究表明，室溫（18～25℃）避光條件下放置6 個(gè)月后，川芎揮發(fā)油中藁本內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由初始的59.89%降至18.10%[11]，因此樣品20180403中藁本內(nèi)酯的含量低于定量限，可能是由于貯存時(shí)間較長(zhǎng)或溫度偏高造成。另外，樣品20180403、20191205 在保留時(shí)間29～35 min 處的色譜峰較其他樣品有較大差異，可能受制備工藝、貯存條件等因素的影響，后續(xù)需要收集更多樣品進(jìn)一步研究。

3.5 結(jié)論

綜上所述，本文建立的潰瘍油HPLC 特征圖譜方法和對(duì)有效成分的含量測(cè)定方法，不僅可以對(duì)該制劑中化學(xué)成分進(jìn)行量化分析和質(zhì)量評(píng)價(jià)，也可以為原料的篩選、制備工藝的優(yōu)化、貯存穩(wěn)定性的考察等方面提供參考。