段思蒙 肖盟 黃晶晶 王賀, 張戈 張京家 康巍 王瞳 肖玉玲 倪芳 高嵐美 葉麗艷 郭鵬豪 萬喆 陳中舉 楊青 林潔 胡慶豐1 李虹玲1 岳娜1 崔蘭英1 李剛1 范會1 蘇丹虹1 劉麗文 田素飛 趙聲遠 杜雪飛2 周宏偉2 徐英春

[1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730；2.“侵襲性真菌病機制研究與精準(zhǔn)診斷”北京市重點實驗室，北京 100730；3. 丹娜(天津)生物科技有限公司，天津 300451；4. 四川大學(xué)華西醫(yī)院，成都 610041；5. 江蘇省人民醫(yī)院(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)，南京 210029；6. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福州 350001；7. 解放軍總醫(yī)院，北京 100036； 8. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510080；9. 北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京 100034；10.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院，武漢 4300030；11. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，杭州 310003；12. 杭州邵逸夫醫(yī)院，杭州 310016 ；13. 浙江省人民醫(yī)院，杭州 310014；14.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，長沙 410008；15.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052；16.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150001；17.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750001；18.山東省立醫(yī)院，濟南 250021；19.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣州 510120；20.遼寧省人民醫(yī)院，沈陽 110000； 21.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110001；22. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海 200025；23. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，哈爾濱 150001；24. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，杭州 310052]

侵襲性真菌病是臨床的一類重要疾病，已成為醫(yī)內(nèi)感染的重要部分。隨著易感人群的增加，侵襲性真菌病的發(fā)病率逐年上升，病死率居高不下[1]。最常見的病原菌是以念珠菌為主的酵母菌，其中，白念珠菌最多，其次為光滑念珠菌。中國醫(yī)院侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHIF-NET)是中國首個針對侵襲性真菌病的全國性多中心研究。本研究作為CHIF-NET項目的一部分，收集了中國地區(qū)22家醫(yī)院1619株酵母樣真菌，通過菌種鑒定、體外藥物敏感性等數(shù)據(jù)分析，為侵襲性酵母菌感染的診治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集中國醫(yī)院侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHIF-NET)中15個省份22家醫(yī)院2012年度(2011年8月1日—2012年7月31日)門急診及住院患者檢出的侵襲性酵母菌菌株，同時收集菌株相關(guān)的臨床及實驗室信息，包括患者年齡、性別、菌株分離時患者所在的科室(門診、急診、病房，病房細分科室包括內(nèi)科、外科、ICU、其他科室)。侵襲性酵母菌收集的標(biāo)本類型包括外周血、其他部位(包括腹水、膿腫、靜脈導(dǎo)管、腦脊液、肺泡灌洗液、膽汁、胸水、組織、關(guān)節(jié)積液和胃液)，剔除同一患者7 d內(nèi)同一部位重復(fù)分離的菌株。

1.2 主要儀器與試劑

梅里?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(VITEK-MS)(法國bioMérieux公司)，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基 (Chromagar)，沙堡弱培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar, SDA，英國Oxoid公司)，Mueller-Hinton瓊脂(葡萄糖美蘭MH瓊脂)。氟康唑藥敏紙片(25 μg,Oxiod)，伏立康唑藥敏紙片(1 μg,Oxiod)，Mueller-Hinton瓊脂(葡萄糖美蘭MH瓊脂)。

1.3 菌種鑒定

凍存菌種送至中心實驗室(北京協(xié)和醫(yī)院)后接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基，35℃孵育48 h后取單菌落于沙堡弱培養(yǎng)基(SDA)進行純化孵育，采用Vitek MS進行復(fù)核鑒定, 對于疑難及少見菌株再進行ITS1/ITS4核糖體轉(zhuǎn)錄間區(qū)(rDNA internal transcribed spacer region，ITS)測序分析, 確保菌株鑒定的準(zhǔn)確性。

1.4 體外藥敏試驗

將2%葡萄糖加入BBL Mueller-Hinton Ⅱ型的瓊脂,再加0.5 μg/mL亞甲藍，制備4 mm厚的瓊脂板。將念珠菌落混入生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，用一次性無菌棉拭子蘸取制備好的菌懸液均勻涂抹到瓊脂表面。將氟康唑(25 μg/片)和伏立康唑(1 μg/片)紙片貼于瓊脂表面，35℃孵育24 h。特殊生長緩慢的分離株(如隱球菌屬)需延長培養(yǎng)。使用CLSI M44-A文件推薦的紙片擴散法測定氟康唑和伏立康唑的抑菌圈直徑并根據(jù)CLSI菌種特異性折點對藥敏結(jié)果進行判定。

以白念珠菌ATCC 90028和近平滑念珠菌ATCC 22019作為藥敏質(zhì)量控制菌。根據(jù)CLSI菌種特異性折點對藥敏結(jié)果進行判定，針對白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌采用CLSI M60念珠菌折點分析，對于其他念珠菌仍采用CLSI M44-S3進行分析。光滑念珠菌對于伏立康唑的敏感性根據(jù)流行病學(xué)折點(ECV)進行判定。分離株原始鑒定結(jié)果與復(fù)核鑒定結(jié)果對比中，顯著錯誤(major errors)為菌種鑒定錯誤，非顯著錯誤(minor errors)為正確鑒定到屬，但未鑒定到種或正確鑒定到菌種復(fù)合體。

2 結(jié) 果

2.1 侵襲性酵母菌分布情況

CHIF-NET項目2012年度收集的1619個菌株中，白念珠菌整體分離率高達43.48%(見表1)。念珠菌屬中白念珠菌所占比例47.4%，其次為熱帶念珠菌(18.0%)、近平滑念珠菌復(fù)合體(16.2%)、光滑念珠菌復(fù)合體(12.0%)。隱球菌屬中，97.1%為新生隱球菌復(fù)合體，毛孢子菌屬總體少見，其中最長見的仍為阿薩希毛孢子菌(77.8%)，具體情況見表2。

表1 1619株酵母菌菌種分布情況

表2 1619株酵母菌樣本分布情況分析

2.2 樣本分布

樣本類型中，血流來源的標(biāo)本類型菌株數(shù)量最多(626株，38.7%)，其次為腹水標(biāo)本(354株，21.9%)及膿腫(159株，9.8%)。念珠菌屬在大部分的標(biāo)本類型中最為常見，其中在血流標(biāo)本分離菌株中占94.4%(591株)；相比血流中隱球菌僅為3.4%(21株)。念珠菌屬中常見的白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌等菌種，非血流標(biāo)本比例大于血流標(biāo)本比例(血流標(biāo)本比例：25.0%～41.6%)。相比，近平滑念珠菌復(fù)合體在血流標(biāo)本的比例(154/472)明顯高于非血流標(biāo)本(見表1)。

2.3 患者性別比例、年齡分布

檢出侵襲性酵母菌患者中男性占比一半以上(62.14%)，女性患者相對較少(37.80%)；年齡范圍0～94歲，其中≥65歲患者498例(30.76%)。

2.4 科室分布

在分離的菌株中，急診患者5.37%(87例)，門診患者3.15%(51例)，未知病區(qū)患者54例。1427(88.14%)例住院患者中，內(nèi)科檢出24.21%(392例)，外科27.24%(441例)，ICU29.28%(474例)，其他科室(包括兒科、婦產(chǎn)科、皮膚科、五官科、中醫(yī)科病房等)占比較少(共7.41%)。檢出率最高的科室為ICU。

2.5 菌株鑒定復(fù)核情況

CHIF-NET 2012年中所有收集的菌株采用Vitek MS進行鑒定，質(zhì)譜鑒定未出結(jié)果的菌株采用分子測序方法進行進一步鑒定。Vitek MS和ITS測序鑒定發(fā)現(xiàn)，復(fù)核鑒定與原始鑒定的一致率為87.28%(1413/1619)。以復(fù)核鑒定的結(jié)果為準(zhǔn)，評價項目中各單位常規(guī)方法鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，其中4株擬平滑念珠菌被錯誤鑒定為近平滑念珠菌，25株熱帶念珠菌被錯誤鑒定為白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌。錯誤鑒定的菌還有白念珠菌、光滑念珠菌，也包括葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、解脂念珠菌等臨床非常見菌株(見表3)。

表3 1619株分離株原始鑒定與復(fù)核鑒定對比

(續(xù)表) %

2.6 體外藥敏試驗

1619株分離株藥敏結(jié)果見表4，念珠菌屬中常見的白念珠菌對氟康唑較為敏感(99.2%)，其次為近平滑念珠菌復(fù)合體和熱帶念珠菌，依次為93.7%和91.7%。白念珠菌、近平滑念珠菌復(fù)合體和熱帶念珠菌對伏立康唑敏感的菌株百分比分別為99.5%、95.0%、92.5%。分離株對氟康唑和伏立康唑的敏感程度從整體來看較接近。白念珠菌和近平滑念珠菌對兩種唑類藥物的敏感性都很高(>93%),熱帶念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥率分別為6.3%和5.9%，其中6%出現(xiàn)交叉耐藥。

表4 2012年CHIF-NET 1619株酵母菌氟康唑及伏立康唑體外藥敏試驗

(續(xù)表) %

2.7 不同菌株在各醫(yī)療機構(gòu)的分布差異

雖然白念珠菌為臨床最常見的念珠菌種，但其發(fā)生率在不同醫(yī)療機構(gòu)存在顯著差異，最高為北京協(xié)和醫(yī)院(PU)，占12.78%，最低為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院(Z2)，僅占1.14%。除東北地區(qū)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(H1)以外，白念珠菌是所有參與研究單位分離株中最常見的念珠菌種，熱帶念珠菌在近一半(45.45%)的醫(yī)院是檢出率排名第二的念珠菌種，發(fā)生率在16.67%～29.79%之間(見圖1)。

圖1 2012年參與CHIF-NET的22個監(jiān)測點在全國的分布情況。BD：北京大學(xué)第一醫(yī)院；FJ:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院；G1：廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；GH：解放軍總醫(yī)院；GZ：中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院；H1：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；H4：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院；HX：四川大學(xué)華西醫(yī)院；JS：江蘇省人民醫(yī)院；LR：遼寧省人民醫(yī)院；NX：寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；PU：北京協(xié)和醫(yī)院；RJ：上海市瑞金醫(yī)院；SD：山東省立醫(yī)院；TJ：華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院；TZ：天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；XY：中南大學(xué)湘雅醫(yī)院；Z1：中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；Z2：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院；Z3：浙江省人民醫(yī)院；ZD：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院；ZS：杭州邵逸夫醫(yī)院

3 討 論

CHIF-NET 2012中國多中心侵襲性酵母菌感染的臨床研究結(jié)果表明：念珠菌屬仍然是最常見的侵襲性酵母菌感染病原體，占分離株的91.8%,其中白念珠菌最為常見占47.4%，與文獻報道一致[2]。在血流樣本分離株中，白念珠菌的分離率依然位居榜首(34.0%)，這一點不同于美國(38.0%)[3]。由非白念珠菌引起的菌血癥超過一半[4-5]，近平滑念珠菌和熱帶念珠菌是位于第2、3位的導(dǎo)致血流感染的病原菌(見表2)。在全球范圍內(nèi)，白念珠菌仍是主要病原菌。

從流行病學(xué)角度分析，納入研究的病例中，男性占62.1%，女性占37.8%，其中≥65歲患者占30.76%，長期使用抗菌藥物的高齡患者易感染。本監(jiān)測顯示，ICU檢出率最高，其次為外科及內(nèi)科。全球范圍內(nèi)ICU侵襲性真菌感染的問題亦很嚴峻[6]。本研究對2012年22家參與單位侵襲性酵母菌分布特點及體外藥敏結(jié)果做了研究分析，為酵母菌感染的診治提供依據(jù)。

研究對1619株真菌進行了復(fù)核鑒定，復(fù)核正確率為87.2%。由于目前實驗室常規(guī)基于生化鑒定的方法不能區(qū)別鑒定到種水平，其中25種似平滑念珠菌被鑒定為近平滑復(fù)合體。此外，還有部分菌株無鑒定結(jié)果如季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌。臨床對于侵襲性真菌病的診治取決于分離菌株的正確鑒定與否，故實驗室在真菌的診斷方面，不僅需要使用常規(guī)的表型鑒定方法，還需要結(jié)合分子生物學(xué)的方法進行確認，研究可以看出，參與的醫(yī)療機構(gòu)利用常規(guī)的監(jiān)測手段鑒定念珠菌的準(zhǔn)確率僅為60.1%，其中出現(xiàn)把季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌、近平滑念珠菌等錯誤鑒定為無名念珠菌的情況，研究中亦發(fā)現(xiàn)毛孢子菌屬的鑒定錯誤，其中3株阿薩希毛孢子菌被錯誤鑒定為白念珠菌，這可能和表型鑒定錯誤相關(guān)。而測序方法雖準(zhǔn)確性高，但也有一定的局限性，如方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，成本也相對較高。綜合考慮，想要兼顧準(zhǔn)確性及較低的成本，VITEK MS略顯其優(yōu)越性。

研究中大部分的白念珠菌(79.83%，736/922)、光滑念珠菌(87.08%，155/178)、近平滑念珠菌(93.78%，226/241)對氟康唑和伏立康唑較敏感，伏立康唑?qū)巳崮钪榈拿舾行钥蛇_91%以上，侵襲性真菌感染的藥物治療中氟康唑不良反應(yīng)小，氟康唑的大量使用已使念珠菌病的致病菌譜發(fā)生了顯著變化，對氟康唑的敏感性也明顯下降。唑類是治療念珠菌感染最常用的藥物，除了固有耐藥比如克柔念珠菌，其他念珠菌如白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌在長期用藥以及過度用藥的情況下亦會出現(xiàn)耐藥[7-11]。近平滑念珠菌對棘白菌素類藥物MIC和其他念珠菌比較相對較高[12]，因此唑類耐藥的近平滑念珠菌將限制臨床的可用治療方案，對臨床意義重大[13]。除此之外，也有少見的念珠菌出現(xiàn)唑類交叉耐藥的情況，如5.99%的熱帶念珠菌和4.56%的近平滑念珠菌出現(xiàn)了氟康唑和伏立康唑的交叉耐藥，出現(xiàn)在非同一醫(yī)療機構(gòu)中。CHIF-NET2012研究中熱帶念珠菌的交叉耐藥率已經(jīng)高于近平滑念珠菌復(fù)合體和白念珠菌，尤其是血流感染，應(yīng)引起關(guān)注。