許雪 鄧淑文 王曉東 趙蓉芬 張虹 于農(nóng) Mohammad Javad Najafzadeh 史冬梅 陸敏

(1. 蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，蘇州 215000；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊 830011；3. Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran；4. 山東濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院皮膚科/醫(yī)學(xué)真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)寧 272000)

甲真菌病是一種常見(jiàn)的由真菌引起的甲感染，病原體包括皮膚癬菌、酵母菌和非皮膚癬菌絲狀真菌(non-dermatophytes mold，NDM)。近年來(lái)，NDM所致甲真菌病(non-dermatophytes mold onycomycosis，NDMO)的發(fā)病率不斷增加[1-2]。曲霉作為非皮膚癬菌絲狀真菌(NDM)，引起NDMO的報(bào)道逐漸增多[3-4]。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，曲霉屬中許多新的菌種被報(bào)道可引起甲真菌病[2,5]。Bongomin[3]綜述了全球42篇甲真菌病流行病學(xué)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)超過(guò)50%(23/42)的研究報(bào)道了曲霉屬菌種可作為甲真菌病的病原菌，占NDMO的50%～100%。在伊朗，既往研究表明曲霉可引起NDMO，且主要致病菌種為黃曲霉(AspergillussectionFlavi)。但值得注意的是，伊朗大多數(shù)研究報(bào)道中，菌種鑒定主要是基于形態(tài)學(xué)鑒定，且關(guān)于分離菌株體外抗真菌活性的研究數(shù)據(jù)很少。由于形態(tài)學(xué)鑒定并不能區(qū)分曲霉屬的近緣種(如AspergillussectionFlavi菌種)，而準(zhǔn)確的曲霉屬菌種鑒定對(duì)臨床選擇最佳治療方案和判斷疾病預(yù)后具有重要作用。

Calmodulin(CaM)或β-tubulin(BenA)基因的部分序列是目前鑒定曲霉屬菌種，尤其曲霉復(fù)合體菌種的推薦鑒定基因[6]。此外，最近的研究表明，MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定可以作為基于DNA序列鑒定曲霉菌種的替代方法[7-8]，尤其是對(duì)一些曲霉同形種(cryptic species)，或者是分子鑒定不能區(qū)分的曲霉屬菌種[7]，例如A.flavus/A.oryzae，MALDI-TOF質(zhì)譜有能力將其區(qū)分開(kāi)[9]。

因此，本研究對(duì)伊朗馬什哈德地區(qū)甲真菌病患者指/趾甲分離基于形態(tài)學(xué)鑒定的39株AspergillussectionFlavi菌株進(jìn)行分子鑒定聯(lián)合MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定。同時(shí)，對(duì)這些菌株進(jìn)行了包括特比萘芬在內(nèi)的10種抗真菌藥物的體外抗真菌活性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 菌種鑒定

39株AspergillussectionFlavi菌株分離自伊朗馬什哈德地區(qū)Emam Reza & Ghaem醫(yī)院診斷為甲真菌病患者的指/趾甲。曲霉菌屬引起的甲真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)[3]滿足以下3點(diǎn)：①直接鏡檢陽(yáng)性；②同部位反復(fù)培養(yǎng)或分子檢測(cè)為曲霉；③未分離出皮膚癬菌。該研究獲得了Mashhad醫(yī)學(xué)科學(xué)大學(xué)倫理委員會(huì)的倫理認(rèn)可和倫理規(guī)范(IR.MUMS.MEDICAL.REC.1397.660)。所有患者都理解并同意將其臨床標(biāo)本用于本研究。

1.2 分子鑒定

39株AspergillussectionFlavi菌株在SDA培養(yǎng)基于35℃培養(yǎng)4～5 d后，采用CTAB法提取菌株基因組DNA[10]。菌種鑒定采用Calmodulin (CaM)和β-tubulin(BenA)基因測(cè)序，引物序列參見(jiàn)表1。測(cè)序獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(BLAST; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和荷蘭真菌多樣化研究中心(Westerdijk Institue)曲霉專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定到菌種水平。

表1 本研究使用引物名稱及序列

1.3 MALDI-TOF 質(zhì)譜鑒定

39株AspergillussectionFlavi菌株在SDA培養(yǎng)基上于35℃培養(yǎng)4～5 d后，采用安圖生物公司MS1000 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定進(jìn)行菌種鑒定。鑒定方法參照說(shuō)明書(shū)，即挑取適量曲霉孢子置于含1 mL 75%酒精的離心管中，混勻后以15 000 rcf離心5 min。棄去上清液，在恒溫金屬浴(Thermo Fisher Scientific, California, United States)上干燥殘留物，然后加入40 μL裂解液1并反復(fù)吹打使之產(chǎn)生氣泡，取1 μL滴于靶板上，在生物安全柜中自然干燥，然后再吸取1 μL基質(zhì)溶液于靶板的相同位置，在生物安全柜中自然干燥。最終，使用AUTOF MS1000質(zhì)譜儀對(duì)產(chǎn)生的質(zhì)譜進(jìn)行積分鑒定。

1.4 抗真菌藥敏試驗(yàn)

參考CLSL M38-A3方案[11]，抗真菌藥物包括：阿尼芬凈(ANF)、卡泊芬凈(CAS)、米卡芬凈(MFG)、兩性霉素B(AmB)、伊曲康唑(ITC)、伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(POS)、雷伏康唑(RAV)、艾沙康唑(ISA)和特比萘芬(TER)。其中，米卡芬凈購(gòu)自多倫多研究化學(xué)品公司，特比萘芬購(gòu)自阿拉丁生化科技公司，其余抗真菌藥物均購(gòu)自Sigma。以C.parapsilosisATCC22019 和A.fumigatusATCC MYA-3627 為質(zhì)控菌株。所有待測(cè)菌株在SDA瓊脂平板35℃培養(yǎng)4～5 d，以進(jìn)行菌株活化。取適量孢子于裝有1 mL無(wú)菌生理鹽水的研磨器中充分研磨，顯微鏡下通過(guò)計(jì)數(shù)板計(jì)算菌懸液的初始濃度并通過(guò)RPMI 1640培養(yǎng)基將菌懸液的最終接種濃度調(diào)整為(0.4～5)×104CFU/mL，然后置于96孔藥敏板中。棘白菌素類(米卡芬凈、阿尼芬凈和卡泊芬凈)抗真菌藥的濃度范圍為0.008～4 mg/L，而其他抗真菌藥的濃度范圍為0.031～16 mg/L。棘白菌素類藥敏板于35℃下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，其他培養(yǎng)板則在35℃下培養(yǎng)48 h。用顯微鏡(Olympus, Japan)在×40倍放大率下測(cè)定最低抑制濃度(MIC)和最低有效濃度(MEC)。表2列出了10種抗真菌藥物的藥物濃度范圍、MIC/MEC讀數(shù)時(shí)間和黃曲霉流行病學(xué)臨界值(epidemiological cutoff values, ECV)。

表2 本研究中檢測(cè)10種抗真菌藥物的濃度范圍、MIC/MEC讀數(shù)時(shí)間、ECV

2 結(jié) 果

2.1 菌種鑒定

以GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(BLAST; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和荷蘭真菌多樣化研究中心(Westerdijk Institue)曲霉專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)為參考數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)根據(jù)CaM和BenA基因序列BLAST比對(duì)分析，基于形態(tài)學(xué)鑒定的39株AspergillussectionFlavi菌株，38株為A.flavus/A.oryzae，1株為A.minisclerotigenes。采用安圖生物MS1000 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀，對(duì)39株AspergillussectionFlavi菌株進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，結(jié)果均為A.flavus，鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 39株Aspergillus section Flavi分子鑒定和MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

2.2 藥敏結(jié)果

表4列出了39株AspergillussectionFlavi對(duì)10種抗真菌藥物MIC/MEC值的范圍、MIC90、GM、Modal MIC 及MIC/MEC分布。

表4 39株Aspergillus section Flavi對(duì)10種抗真菌藥物MIC/MEC值的范圍、MIC90、GM菌株分布

38株A.flavus對(duì)10種抗真菌藥物的Modal MIC和 GM(mg/L)值依次為(遞增順序)米卡芬凈(0.008)、阿尼芬凈(0.008)、特比萘芬(0.03)、泊沙康唑(0.097)、卡泊芬凈(0.142)、艾沙康唑(0.274)、伏立康唑(0.274)、伊曲康唑(0.311)、雷伏康唑(0.394)、兩性霉素B(2.151)。

1株A.minisclerotigenes對(duì)10種抗真菌藥物的MIC/MEC(mg/L)值分別為(遞增順序)：米卡芬凈(0.008)、阿尼芬凈(0.008)、特比萘芬(0.03)、N：沒(méi)有鑒定結(jié)果。

卡泊芬凈(0.125)、伏立康唑(0.25)、艾沙康唑(0.25)、伊曲康唑(0.25)、雷伏康唑(0.5)、泊沙康唑(0.5)、兩性霉素B(1)。

3 討 論

本研究報(bào)道了伊朗馬什哈德地區(qū)致甲真菌病的AspergillussectionFlavi菌種的分子特征以及其對(duì)10種抗真菌藥物的體外敏感性。

研究結(jié)果表明A.flavus是伊朗馬什哈德地區(qū)AspergillussectionFlavi引起甲真菌病的主要菌種。在伊朗，已有研究報(bào)道曲霉屬菌種(主要是AspergillussectionFlavi)是NDM致甲真菌病的常見(jiàn)致病菌種[12-14]。我們的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AspergillussectionFlavi中A.flavus是主要致病菌種。此外，A.flavus也是伊朗地區(qū)慢性真菌性鼻竇炎的主要病原菌[15]。這可能是由于伊朗氣候溫暖，有利于黃曲霉等耐熱真菌的生長(zhǎng)。

根據(jù)新近分類，分子鑒定將A.minisclerotigenes歸屬于AspergillussectionFlavi，該菌種與A.flavus系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化親緣性相近[16]?；贜CBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，本研究中CaM基因不能將A.minisclerotigenes與A.flavus分開(kāi)，而B(niǎo)enA基因鑒定為A.minisclerotigenes，并進(jìn)一步在荷蘭真菌多樣化研究中心(Westerdijk Institue)曲霉專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)，由此說(shuō)明多個(gè)基因位點(diǎn)聯(lián)合鑒定可以更準(zhǔn)確鑒定至菌種水平。伊朗學(xué)者Dehhan等[17]首次報(bào)道A.minisclerotigenes可引起人類感染。另一伊朗學(xué)者Esfahani等[18]報(bào)道1例由A.minisclerotigenes引起的真菌性角膜炎病例，建議許多的A.minisclerotigenes可能因基于形態(tài)學(xué)鑒定而被錯(cuò)誤鑒定為黃曲霉，從而被忽視了。本研究首次報(bào)道A.minisclerotigenes為甲真菌病的病原菌。

由于A.flavus和A.oryzae分子序列相似度很高，CaM和BenA兩個(gè)基因均不能將A.flavus與A.oryzae區(qū)分。因此，目前這兩個(gè)菌種的鑒定主要依賴菌株來(lái)源和真菌毒素的產(chǎn)生而鑒別：A.oryzae通常在食物發(fā)酵和生物技術(shù)中廣泛使用，不產(chǎn)生真菌毒素，而A.flavus產(chǎn)生黃曲霉毒素[19]，不用于食品加工。而 MALDI-TOF 質(zhì)譜鑒定將本研究的指/趾甲分離38株A.flavus菌株正確鑒定，與Chang等[9]報(bào)道相同。MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定可將A.flavus與A.oryzae鑒別，可能是這兩個(gè)菌種在氨基酸水平的差異。然而，MALDI-TOF質(zhì)譜將1株A.minisclerotigenes錯(cuò)誤鑒定為A.flavus，因本研究使用的MALDI-TOF質(zhì)譜儀的真菌數(shù)據(jù)庫(kù)未包含此少見(jiàn)的新菌種，說(shuō)明MALDI-TOF質(zhì)譜的準(zhǔn)確菌種鑒定需要繼續(xù)完善參考菌株數(shù)據(jù)庫(kù)。我們的研究表明將分子鑒定和MALDI-TOF質(zhì)譜兩者結(jié)合能更準(zhǔn)確鑒定曲霉屬菌種。

體外抗真菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明特比萘芬(GM：0.03 mg/L，Modal MIC：0.03 mg/L，n=35)對(duì)AspergillussectionFlavi菌種具有良好的抗真菌活性，且抗菌活性明顯高于唑類藥物和兩性霉素B。與既往研究結(jié)果相似[20-21]。而且已有許多研究報(bào)道特比萘芬在臨床治療曲霉引起的甲真菌病中具有良好的臨床活性[3,22]。因此，特比萘芬可作為AspergillussectionFlavi所致甲真菌病的治療選擇。

黃曲霉的ECV值參照CLSI M61方案[23](泊沙康唑0.5 mg/L；伊曲康唑1 mg/L；伏立康唑1 mg/L；艾沙康唑1 mg/L和兩性霉素B 4 mg/L)，本研究中所檢測(cè)的5種唑類藥物對(duì)38株A.flavus均具有良好的活性。其中泊沙康唑GM值最低(0.097 mg/L)，其次是伏立康唑和艾莎康唑(均為0.274 mg/L)，然后是伊曲康唑(0.311 mg/L)和雷伏康唑(0.394 mg/L)。雖然目前還沒(méi)有雷伏康唑的流行病學(xué)臨界值，我們的研究中發(fā)現(xiàn)所有的AspergillussectionFlavi菌株對(duì)雷伏康唑的MIC值(MIC 范圍：0.25～0.5 mg/L)均小于1 mg/L，與Pfaller等[24]的研究結(jié)果相似。除此之外，兩性霉素B對(duì)所有檢測(cè)AspergillussectionFlavi菌株的MIC值均較高(GM：2.109 mg/L；MIC范圍：1～4 mg/L)，其中有9株菌的MIC值為4 mg/L，與美國(guó)、歐洲以及中東地區(qū)先前的報(bào)道相似。本研究結(jié)果表明A.minisclerotigenes和A.flavus的體外抗真菌活性沒(méi)有明顯差異。

本研究中所檢測(cè)的三個(gè)棘白菌素類抗真菌藥物對(duì)所有AspergillussectionFlavi菌株均顯示良好的活性，其中米卡芬凈和阿尼芬凈具有相似MIC值(MIC值范圍為0.008～0.015 mg/L)，而卡泊芬凈的MIC值范圍為0.125～0.5 mg/L。與既往研究相似，表明米卡芬凈和阿尼芬凈比卡泊芬凈敏感性高[20,25]。

根據(jù)分子鑒定聯(lián)合MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果，表明在伊朗馬什哈德地區(qū)AspergillussectionFlavi菌種中A.flavus是引起甲真菌病的最常見(jiàn)菌種。本文首次報(bào)道A.minisclerotigenes可作為甲真菌病的致病菌。建議分子測(cè)序聯(lián)合MALDI-TOF質(zhì)譜能更精準(zhǔn)鑒定AspergillussectionFlavi到菌種水平。因不同的菌種對(duì)抗真菌藥物的敏感性可能不同，正確鑒定曲霉至菌種水平對(duì)敏感藥物的選擇具有重要作用。除此之外，本研究結(jié)果表明特比萘芬、泊沙康唑和棘白菌素類藥物是治療AspergillussectionFlavi引起的甲真菌病的潛在有效藥物，但其在體內(nèi)的療效有待進(jìn)一步確定。