郭鵬豪 伍眾文 邱丹萍 謝梅英 劉敏 廖康

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣州 520080； 2.廣西玉林市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,玉林 537000；3.廣西防城港市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，防城港 538000)

馬爾尼菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei)既往稱為馬爾尼菲青霉[1-2]，1956年由Capponi等從中華竹鼠中分離出來[3]。該菌是一種雙相真菌，在不同溫度下具有不同的菌落形態(tài)[4]。在HIV/AIDS患者中，馬爾尼菲籃狀菌是僅次于結(jié)核分枝桿菌和隱球菌的第三大病原體[5]。在香港約有10%的HIV/AIDS患者感染馬爾尼菲籃狀菌[6]。作為臨床侵襲性真菌感染的重要病原體之一，目前馬爾尼菲籃狀菌鑒定主要依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和基因測(cè)序。然而形態(tài)學(xué)鑒定耗時(shí)、準(zhǔn)確率低；基因測(cè)序目前難以在臨床實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)進(jìn)行。因此，如何準(zhǔn)確、快速地鑒定馬爾尼菲籃狀菌仍然是一個(gè)難題。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是一種革命性的病原體鑒定技術(shù)，其鑒定速度快、準(zhǔn)確性高[7]。Vitek MS是法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的一種商業(yè)化用于病原體鑒定的質(zhì)譜儀。目前Vitek MS的IVD數(shù)據(jù)庫(版本3.0)和RUO SARAMIS數(shù)據(jù)庫(版本4.14)均無法對(duì)馬爾尼菲籃狀菌進(jìn)行鑒定。本研究通過在Vitek MS的RUO模式建立包含馬爾尼菲籃狀菌超級(jí)圖譜的自建庫，實(shí)現(xiàn)Vitek MS對(duì)馬爾尼菲籃狀菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌株

共收集馬爾尼菲籃狀菌41株，包括40株臨床菌株(剔除同一患者的重復(fù)菌株)和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC18224。臨床菌株來自廣東省廣州市(6株)，廣西壯族自治區(qū)玉林市(20株)和廣西壯族自治區(qū)防城港市(14株)。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC18224和15株臨床菌株(每個(gè)城市隨機(jī)選取5株菌)用于建立馬爾尼菲籃狀菌自建庫(見表1)；其余25株非建庫的馬爾尼菲籃狀菌及30株臨床常見的其他真菌(白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、茄病鐮刀菌、小孢根霉、紅色毛癬菌、橘青霉、宛氏擬青霉、短帚霉各2株)用于驗(yàn)證建立的自建庫。

表1 用于自建庫建立15株馬爾尼菲籃狀菌的標(biāo)本信息

1.2 主要試劑和儀器

真菌基因組DNA提取試劑盒與蝸牛酶購自上海生工生物工程股份有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Taq酶及PCR反應(yīng)體系購自TaKaRa公司；ABI 9700擴(kuò)增儀；Vitek MS質(zhì)譜儀購自法國生物梅里埃公司；沙堡弱平板(SDA)購自法國生物梅里埃公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板(PDA)購自中國江門凱林貿(mào)易有限公司。

1.3 馬爾尼菲籃狀菌菌株的分子生物學(xué)鑒定

所有臨床分離馬爾尼菲籃狀菌菌株鑒定通過ITS序列的測(cè)序分析。DNA提取操作嚴(yán)格遵守真菌基因組DNA提取試劑盒說明書。采用通用引物ITS1和 ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，其中ITS1的堿基序列為5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4的堿基序列為5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反應(yīng)體系：DNA模板 5 μL，引物ITS1和ITS4各1 μL，dNTP Mixture 4 μL，10×PCR buffer 5 μL，Taq酶0.5 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min， 94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，-20℃保存。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank 中已知標(biāo)準(zhǔn)或臨床菌株DNA序列進(jìn)行比對(duì)，一致性≥99%時(shí)可確定至菌種水平。

1.4 建庫菌株質(zhì)譜數(shù)據(jù)的獲取

每株馬爾尼菲籃狀菌接種4個(gè)培養(yǎng)基：2個(gè)PDA平板和2個(gè)SDA平板；其中1個(gè)PDA平板和1個(gè)SDA平板置于37℃孵育，另外1個(gè)PDA平板和1個(gè)SDA平板置于28℃孵育；所有的菌株均培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)的第4 d、5 d、6 d用無菌棉簽刮取建庫菌株在不同培養(yǎng)條件下的菌落，通過微型玻璃珠研磨結(jié)合甲酸/乙腈提取法進(jìn)行預(yù)處理，在Vitek MS質(zhì)譜儀RUO模式下采集不同平板、不同時(shí)間點(diǎn)菌絲相和酵母相菌落的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。每株菌重復(fù)檢測(cè)兩次。

菌株的預(yù)處理步驟：①將菌株轉(zhuǎn)移至含有微型玻璃珠及900 μL 70%的乙醇溶液的EP管，震蕩2 min，靜置。②靜置后的菌液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，13000 min離心2 min，棄去上清液，晾干。③向EP管中加入70%的甲酸溶液，震蕩1 min，加入40 μL乙腈，繼續(xù)震蕩1 min；13000 r/min離心2 min。④吸取1 μL上清液涂于靶板，晾干后加1 μL CHCA基質(zhì)液覆蓋，待干燥后放入Vitek MS儀器，在RUO模式下進(jìn)行檢測(cè)，獲取菌株的圖譜。

1.5 自建庫的建立

將ATCC 18224和15株臨床建庫菌株的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SARAMIS Premium軟件。通過聚類分析對(duì)所有的圖譜進(jìn)行分析。根據(jù)聚類分析的結(jié)果，將異常值從數(shù)據(jù)庫中刪除。根據(jù)SARAMIS手冊(cè)中制造商的描述，按照SARAMIS Premium工具創(chuàng)建超級(jí)圖譜。最后將建立的超級(jí)圖譜添加到SARAMIS數(shù)據(jù)庫并激活，建立含有馬爾尼菲籃狀菌超級(jí)圖譜的自建庫。

1.6 自建庫的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

用無菌棉簽刮取馬爾尼菲籃狀菌非建庫菌株在PDA平板和SDA平板培養(yǎng)成熟的菌絲相菌落和酵母相菌落，通過與建庫菌株相同的方法進(jìn)行預(yù)處理后，在Vitek MS的RUO模式下進(jìn)行檢測(cè)，并通過自建庫對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。置信度值為80%被認(rèn)為是可靠的鑒定結(jié)果。如果第1次無法鑒定，則按照上述流程再次進(jìn)行檢測(cè)。 如果第2次仍然無法鑒定，則認(rèn)為鑒定失敗。另外30株臨床常見的真菌根據(jù)廠家念珠菌及絲狀真菌的操作流程進(jìn)行前處理，并利用自建庫進(jìn)行鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 菌株鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)以后，均擴(kuò)增出長度為600bp左右的條帶。使用Vector NTI軟件程序?qū)y(cè)序獲得的核苷酸序列進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)后的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)后顯示與馬爾尼菲籃狀菌具有99%的一致性。所有臨床菌株均鑒定為馬爾尼菲籃狀菌。

2.2 馬爾尼菲籃狀菌自建庫的建立

通過對(duì)建庫菌株的質(zhì)譜檢測(cè)，共獲得了384個(gè)質(zhì)譜圖。其中40個(gè)質(zhì)譜圖由于數(shù)據(jù)質(zhì)量差被剔除，其余的344個(gè)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)被導(dǎo)入SARAMIS Preminm軟件包。通過SARAMIS軟件進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果顯示在不同條件下培養(yǎng)的同一菌株的質(zhì)譜圖之間沒有明顯的差異。不同平板、不同培養(yǎng)時(shí)間和不同溫度下菌株的質(zhì)譜圖非常相似(見圖1)。根據(jù)廠家說明書關(guān)于超級(jí)圖譜的建立流程，使用SARAMIS Preminm軟件建立了包含39個(gè)特征峰的馬爾尼菲籃狀菌的超級(jí)圖譜(見圖2)。建立超級(jí)圖譜后，將該超級(jí)圖譜進(jìn)行激活，對(duì)SARAMIS Preminm數(shù)據(jù)庫進(jìn)行擴(kuò)展，建立馬爾尼菲籃狀菌自建庫。

圖1 ATCC 18224在不同培養(yǎng)條件下菌落的質(zhì)譜圖

2.3 自建庫的驗(yàn)證

在培養(yǎng)的第4天，采集24株非建庫馬爾尼菲籃狀菌在PDA和SDA上的酵母相和菌絲相菌落，通過微型玻璃珠研磨結(jié)合甲酸/乙腈提取法進(jìn)行預(yù)處理，在Vitek MS的RUO模式下利用馬爾尼菲籃狀菌自建庫進(jìn)行鑒定；另外1株菌由于生長緩慢，其檢測(cè)和分析在培養(yǎng)的第6天進(jìn)行。25株馬爾尼菲籃狀菌在PDA、SDA培養(yǎng)基上的酵母相和菌絲相菌落均鑒定為馬爾尼菲籃狀菌，準(zhǔn)確率為100.0%；另外30株臨床常見的真菌均準(zhǔn)確鑒定到種。部分驗(yàn)證菌株的質(zhì)譜圖譜見圖3。

圖2 含有39個(gè)特征峰的馬爾尼菲籃狀菌超級(jí)圖譜 圖3 馬爾尼菲籃狀菌與短帚霉、擬青霉的圖譜結(jié)果

3 討 論

馬爾尼菲籃狀菌是一種雙相真菌，可以引起身體多部位的感染，包括肺部、淋巴結(jié)、血液和軟組織等。菌株的快速、準(zhǔn)確鑒定對(duì)患者的診斷、治療和改善預(yù)后具有重要的作用。但是，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定對(duì)于實(shí)驗(yàn)室操作人員的經(jīng)驗(yàn)要求高，耗時(shí)長，經(jīng)常鑒定錯(cuò)誤，從而延誤治療?；驕y(cè)序是馬爾尼菲籃狀菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，通過特異性引物對(duì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)(ITS)和5.8S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序[8]，但是尚無法在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展檢測(cè)。

MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)改變了傳統(tǒng)的微生物鑒定方法，可以在幾分鐘內(nèi)提供菌株的鑒定結(jié)果。該技術(shù)操作簡單、成本低、準(zhǔn)確率高[9]，對(duì)細(xì)菌、真菌和分枝桿菌具有良好的鑒定能力[10]；其通過獲取微生物的蛋白圖譜，并與數(shù)據(jù)庫中已知微生物的圖譜進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)最接近的匹配關(guān)系達(dá)到對(duì)未知菌株的鑒定。目前主流的商業(yè)化MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)庫均不包括馬爾尼菲籃狀菌的超級(jí)圖譜。因此有必要建立馬爾尼菲籃狀菌質(zhì)譜鑒定的方法。

質(zhì)譜鑒定的結(jié)果會(huì)受到培養(yǎng)基基質(zhì)、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間、菌株蛋白提取方法等因素的影響，如煙曲霉生長早期(48 h)鑒定效果差，培養(yǎng)72 h后準(zhǔn)確率穩(wěn)定[11]。李鳳琴等[12]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)條件的改變，會(huì)導(dǎo)致微生物內(nèi)生物大分子發(fā)生變化。本研究將不同地區(qū)、不同生長階段、不同溫度和不同培養(yǎng)基等因素均考慮在內(nèi)，在Vitek MS質(zhì)譜平臺(tái)成功構(gòu)建含有39個(gè)特征峰的馬爾尼菲籃狀菌超級(jí)圖譜，該研究結(jié)果與布魯克平臺(tái)上建立的超級(jí)圖譜相似[13]。需要指出的是，本研究結(jié)果顯示不同培養(yǎng)條件下獲取的馬爾尼菲籃狀菌圖譜無顯著差異。通過SARAMIS高級(jí)軟件聚類分析后顯示在不同條件下培養(yǎng)的同一菌株的質(zhì)譜圖之間沒有明顯的聚類現(xiàn)象。Lau等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，在其研究中馬爾尼菲籃狀菌的菌絲相和酵母相培養(yǎng)物的圖譜相似。由于本研究的菌株數(shù)量有限，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大菌株的數(shù)量進(jìn)行驗(yàn)證才能得出更為確切的結(jié)論。

本研究建立的自建庫對(duì)于馬爾尼菲籃狀菌具有很高的鑒定準(zhǔn)確率，其準(zhǔn)確率達(dá)100.0%，與Lau等[7]的研究結(jié)果一致。經(jīng)過驗(yàn)證，也進(jìn)一步證實(shí)建立的自建庫能夠很好地將馬爾尼菲籃狀菌與臨床其他常見的真菌進(jìn)行較好的區(qū)分。本研究由于無籃狀菌屬內(nèi)其他種的菌株，因此無法直接評(píng)估自建庫將馬爾尼菲籃狀菌與其他籃狀菌的區(qū)分能力，但是通過與SARAMIS Preminm數(shù)據(jù)庫中自帶的菌種，如紫色籃狀菌、皺褶籃狀菌的圖譜具有明顯的區(qū)別，通過聚類分析也能將馬爾尼菲籃狀菌與這些菌種進(jìn)行較好的區(qū)分。

自建庫的建立雖然有益于擴(kuò)展現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的鑒定能力，彌補(bǔ)鑒定方法的不足，但是也必須意識(shí)到自建庫可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)室使用自建庫用于微生物的鑒定和報(bào)告，屬于臨床實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目(LDT)。LDT是實(shí)驗(yàn)室自行研發(fā)、驗(yàn)證和使用的檢測(cè)項(xiàng)目，僅在研發(fā)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用，不作為商品出售給其他實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院及個(gè)人。作為臨床實(shí)驗(yàn)室開展LDT，可參照相關(guān)技術(shù)指南中建議的模式在項(xiàng)目研發(fā)、項(xiàng)目投入臨床檢測(cè)前確認(rèn)、項(xiàng)目投入臨床檢測(cè)后的質(zhì)量監(jiān)管流程做好LDT質(zhì)量管理[14]。因此在日常工作中用自建庫對(duì)馬爾尼菲籃狀菌進(jìn)行鑒定時(shí)，仍然需要結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，當(dāng)兩者結(jié)果不一致時(shí)采用分子測(cè)序的方法進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

綜上所述，通過在Vitek MS平臺(tái)建立超級(jí)圖譜，對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行擴(kuò)展以后，實(shí)驗(yàn)室可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于馬爾尼菲籃狀菌的快速和準(zhǔn)確鑒定。同時(shí)表明Vitek MS質(zhì)譜儀具有很強(qiáng)的擴(kuò)展性。隨著數(shù)據(jù)庫的不斷完善，MALDI-TOF MS不僅在細(xì)菌、念珠菌的鑒定方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)，也勢(shì)必成為解決絲狀真菌快速、準(zhǔn)確鑒定的一種方法。