李彩東， 張旭強(qiáng)， 雷志萍， 陳俏麗， 陳 璐， 田鵬飛， 段正軍

（1.蘭州市第二人民醫(yī)院肝病研究所，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅省科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所，甘肅 蘭州 730000）

細(xì)胞因子對(duì)乙型肝炎的作用很復(fù)雜，輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）是分泌細(xì)胞因子的主要細(xì)胞，可分為Th1亞群和Th2亞群，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起重要作用。急性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染中Th1類細(xì)胞因子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，慢性HBV感染則由Th2類細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫，Th1/Th2失衡可能是HBV感染慢性化的機(jī)制之一[1]。關(guān)于HBV患者Th1、Th2細(xì)胞因子的研究是目前HBV發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）1主要由單核巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)中有重要價(jià)值。IL-6可通過抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）來保護(hù)細(xì)胞，從而發(fā)揮抗炎作用，是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵細(xì)胞因子[2]。TNF-α主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，在HBV感染患者肝硬化及肝癌演變過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。本研究擬分析IL-1β、IL-6和TNF-α水平與慢性HBV感染患者不同臨床病程的相關(guān)性，為研究細(xì)胞因子在慢性HBV發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年9月—2019年5月蘭州市第二人民醫(yī)院住院及肝病門診收治的H B V 感染患者240例，其中男181例、女59例，年齡（45.38±12.72）歲。依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[4]中的肝病臨床進(jìn)程，將患者分為乙型肝炎病毒攜帶（asymptomatic hepatitis B virus carrier，ASC）組、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）組、乙型肝炎肝硬化（liver cirrhosis，LC）組和原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）組，每組60例，所有患者排除其他肝炎病毒感染等疾病。另選取同期蘭州市第二人民醫(yī)院體檢中心健康體檢者60名，其中男30名、女30名，年齡（39.15±14.95）歲，排除各型肝炎病毒感染和心、肺等臟器的疾病，肝功能均正常。

1.2 樣本采集和處理

采集所有對(duì)象空腹靜脈血4 mL，室溫靜置2 h后，2 506×g離心5 min，分離血清待測(cè)。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，檢測(cè)儀器為ST-360酶標(biāo)儀（上?？迫A公司）。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)HBV DNA載量，試劑盒購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司，檢測(cè)儀器為Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase）、總膽紅素（total bilirubin，TB）及白蛋白（albumin，Alb）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自蘭州創(chuàng)新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，檢測(cè)儀器為AU680全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。所有項(xiàng)目均重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0及Origin 8.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用最小顯著差異法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較

ASC組、CHB組、LC組和HCC組IL-1β、IL-6及TNF-α水平均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。HCC組IL-1β、IL-6水平顯著低于ASC組、CHB組、LC組（P＜0.01），ASC組TNF-α水平顯著低于LC組（P＜0.01），其他指標(biāo)各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較 ±s

表1 各組IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較 ±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與ASC組比較，#P＜0.01；與CHB組比較，△P＜0.01；與LC組比較，▲P＜0.01。

組別 例數(shù) IL-1β/（pg/mL） IL-6/（ng/L） TNF-α/（ng/L）ASC組 60 804.80±154.24* 95.12±12.37* 64.38±24.89*▲CHB組 60 710.43±152.89* 80.93±10.87* 82.44±26.54*LC組 60 733.26±106.85* 76.26±10.57* 108.50±33.64*HCC組 60 391.50±38.57*# 52.14±3.06*#△▲ 85.69±36.26*正常對(duì)照組 60 118.55±74.05 25.79±5.41 33.57±16.58

2.2 慢性HBV感染各組外周血細(xì)胞因子與HBV DNA載量及肝功能指標(biāo)的相關(guān)性

ASC組、CHB組IL-1β、IL-6、TNF-α與HBV DNA載量、ALT、AST、TB、Alb均無相關(guān)性（P＞0.05）。LC組除IL-6與ALT呈負(fù)相關(guān)（r=-0.314，P＜0.05）外，其他各項(xiàng)指標(biāo)之間均無相關(guān)性（P＞0.05）。HCC組除TNF-α與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.348，P＜0.05）外，其他各項(xiàng)指標(biāo)之間均無相關(guān)性（P＞0.05）。見表2～表5、圖1、圖2。

圖1 LC組IL-6與ALT的相關(guān)性

圖2 HCC組TNF-α與HBV DNA載量的相關(guān)性

表2 ASC組IL-1β、IL-6、TNF-α與HBV DNA載量、ALT、AST、TB、Alb的相關(guān)性

表3 CHB組IL-1β、IL-6、TNF-α與HBV DNA載量、ALT、AST、TB、Alb的相關(guān)性

表4 LC組IL-1β、IL-6、TNF-α與HBV DNA載量、ALT、AST、TB、Alb的相關(guān)性

表5 HCC組IL-1β、IL-6、TNF-α與HBV DNA載量、ALT、AST、TB、Alb的相關(guān)性

3 討論

Th分泌的細(xì)胞因子參與了人體免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，是維持機(jī)體發(fā)揮正常免疫的前提[5-6]。慢性HBV感染是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子。

IL-1可以分為IL-1α和IL-1β 2種亞型，IL-1α由159個(gè)氨基酸組成，IL-1β由153個(gè)氨基酸組成，由不同的基因分別編碼，雖然IL-1α和IL-1β的氨基酸序列僅有26%的同源性，但I(xiàn)L-1α和IL-1β以同樣的親和力結(jié)合于相同的細(xì)胞表面受體，發(fā)揮相同的生物學(xué)作用[7]。柴曉哲等[8]的研究結(jié)果顯示，CHB患者血清IL-1β水平為（64.36±21.53）ng/mL，明顯高于IL-1α[（15.15±11.57）ng/mL]（P＜0.05），說明在CHB患者體內(nèi)，IL-1β是起主要作用的IL-1蛋白。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，ASC組、CHB組、LC組和HCC組外周血IL-1β水平均顯著升高（P＜0.01），提示IL-1β作為肝細(xì)胞損傷的介質(zhì)，參與了乙型肝炎的免疫病理?yè)p傷過程，表明IL-1β與慢性HBV感染患者肝炎發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程密切相關(guān)。當(dāng)HBV入侵肝臟時(shí)，肝細(xì)胞會(huì)過度分泌IL-1，參與肝臟的免疫損傷和炎癥活動(dòng)，促進(jìn)HBV感染向CHB、LC和HCC發(fā)展[9]。本研究結(jié)果還顯示，HCC組IL-1β水平明顯低于ASC組、CHB組和LC組（P＜0.01）。李天駒等[10]的研究結(jié)果顯示，HBV蛋白可影響肝臟固有免疫，HBV蛋白及其末端蛋白（terminal protein，TP）區(qū)通過調(diào)節(jié)核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NFκB）信號(hào)通路和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotide binding domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體信號(hào)通路，以抑制脂多糖誘導(dǎo)的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（cysteine-containing aspartate-specific protease-1，Caspase-1）的激活，減少活化IL-1β的生成及分泌，提示HCC患者較ASC、CHB和LC患者有更高的HBV蛋白活性，從而導(dǎo)致其IL-1β水平降低。由此可見，HCC細(xì)胞可通過下調(diào)自身IL-1β受體及微環(huán)境中IL-1β的水平來降低IL-1β水平，從而逃避IL-1β對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用。

IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，具有多種生物學(xué)特性，是一種多功能炎癥因子[11]。有研究結(jié)果表明，HBVX基因編碼的X蛋白可以激活I(lǐng)L-6，產(chǎn)生的IL-6又可以調(diào)節(jié)HBV的表達(dá)和復(fù)制[12]。IL-6還可以通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和致敏B淋巴細(xì)胞等途徑來?yè)p傷肝細(xì)胞，與肝細(xì)胞壞死及肝纖維化程度密切相關(guān)[13-14]。本研究結(jié)果顯示，ASC組、CHB組、LC組和HCC組IL-6水平均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），提示IL-6與慢性HBV感染患者的炎癥病理過程密切相關(guān)。本研究中，LC組IL-6水平與ALT水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.314，P＜0.05），這可能與IL-6是一種多功能炎癥因子有關(guān)，其在LC患者體內(nèi)也可作為一種抗炎因子存在，可平衡炎癥因子引起的損傷效應(yīng)，從而對(duì)肝細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用[2，11]。本研究ASC組、CHB組和HCC組IL-6水平與ALT水平均無相關(guān)性（r值分別為0.103、0.062、-0.007，P＞0.05），這與文獻(xiàn)報(bào)道[15]有所不同，可能與本研究樣本量較少有關(guān)，具體原因還有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

TNF-α主要由肝臟產(chǎn)生，肝臟中也存在著大量TNF-α的受體[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝炎患者體內(nèi)TNF-α大量積累，其水平變化與LC和肝癌的發(fā)展聯(lián)系緊密[17]。還有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α水平的升高與肝纖維化的嚴(yán)重程度有關(guān)[比值比（odds ratio，OR）值為3.39，P＜0.001][18]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，ASC組、CHB組、LC組和HCC組外周血TNF-α水平均顯著升高，其中LC組TNF-α水平最高，ASC組最低，提示HBV刺激可能會(huì)直接導(dǎo)致TNF-α水平升高，且慢性HBV感染者體內(nèi)存在不同程度的炎癥反應(yīng)。慢性肝損傷最終的病理改變是LC的形成，TNF-α可能在較早階段就參與了肝纖維化及肝癌的發(fā)生過程。本研究結(jié)果還顯示，HCC組TNF-α水平與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.348，P＜0.05），提示在末期肝病的發(fā)生、發(fā)展過程中，TNF-α可能也扮演著重要角色。而ASC組、CHB組和LC組TNF-α水平與HBV DNA載量均無相關(guān)性（r值分別為0.117、-0.164、0.105，P＞0.05），說明TNF-α可能對(duì)ASC、CHB和LC患者疾病進(jìn)展中的病毒復(fù)制影響較小。

鄒綺明[19]在研究不同臨床病程（ASC、CHB、LC、HCC）慢性HBV感染者與HBV DNA載量及ALT水平的相關(guān)性時(shí)，將患者分為不同乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物（hepatitis B virus serum marker，HBV-M）表達(dá)模式[HBeAg（+）、HBeAg（-）]組，結(jié)果顯示，不同臨床病程患者HBV DNA載量及ALT水平與不同HBV-M表達(dá)模式具有較好的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，IL-6水平與ALT水平僅在LC患者中呈負(fù)相關(guān)（r=-0.314，P＜0.05），TNF-α水平與HBV DNA載量?jī)H在HCC患者中呈負(fù)相關(guān)（r=-0.348，P＜0.05），這可能也與納入患者的HBV-M表達(dá)模式有關(guān)。因此，后續(xù)研究將會(huì)探討不同HBV-M表達(dá)模式下IL-6及TNF-α水平與肝功能損傷指標(biāo)及HBV DNA載量的相關(guān)性。

綜上所述，血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平或可用于評(píng)估慢性HBV感染患者病情的嚴(yán)重程度。IL-1β、IL-6和TNF-α在HBV感染不同臨床病程中的作用機(jī)制還有待更深入的研究。