鄭美青 薛 冰 趙淑銳 宋學(xué)英

(首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069)

血小板在止血、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理過(guò)程中有重要作用。血小板的主要生理功能是參與止血與血栓形成。正常血液中的血小板處于“靜息”狀態(tài)，呈圓盤狀，當(dāng)血小板受到一定刺激時(shí)就會(huì)被活化[1]，膜空間構(gòu)形發(fā)生改變，血小板表面GPⅡb-Ⅲa 復(fù)合物的纖維蛋白原受體位點(diǎn)暴露，這些受體與血液中的纖維蛋白原結(jié)合而導(dǎo)致血小板聚集[2-4]。

在血小板的活化研究中，國(guó)內(nèi)外較普遍的研究方法是利用流式細(xì)胞儀對(duì)血小板活化后分泌的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，該方法雖然可以對(duì)血小板分泌的物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，但缺乏確鑿的影像學(xué)支持[5-8]。

原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy, AFM)原理是在反饋控制系統(tǒng)的作用下，根據(jù)微小探針與樣品間的相互作用，去感觸樣品表面形貌的變化，就如同人在大腦地控制下，用手去感觸物體表面形貌[9]。原子力顯微鏡作為生物成像研究中的有力工具, 目前已經(jīng)在生物材料的研究領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用[10，11]。用原子力顯微鏡觀察血小板的形貌變化實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常會(huì)遇到制樣技術(shù)的不成功直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。因?yàn)檠“逶诓杉?、保存過(guò)程中受多種因素影響，其代謝和生理活性很容易發(fā)生改變和活化，因此，血小板的制樣方法至關(guān)重要，本文主要討論血小板制樣技術(shù)對(duì)原子力顯微鏡成像結(jié)果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用儀器是Bruker Multimode 8 原子力顯微鏡，探針SNL-A、云母片和硅片均購(gòu)于某公司。

2 以云母和硅片為基底的血小板制樣

在原子力顯微鏡成像中最常用的基材是白云母，一種常見(jiàn)的層狀硅鋁酸鹽，層與層間易解離，而解離后具有原子級(jí)的平整度，它提供高度帶負(fù)電荷的表面，且天然親水。云母晶體顯示出很大程度的基礎(chǔ)分裂，使其可以分裂成原子平坦的薄片，所以常被用作基底材料[12]。

硅片也是原子力顯微鏡常用的基底之一，新購(gòu)買的硅片可以直接制樣，使用后的硅片一般要用濃硫酸與30%雙氧水的7∶3混合液在70℃煮1h，或者用酒精清洗之后方可制樣。

(1)采集健康SD大鼠的頸動(dòng)脈血，加入3.8%的枸櫞酸鈉溶液抗凝(血與抗凝劑體積比9∶1)，1000 rpm/min離心10分鐘，沉淀血細(xì)胞，取上清得到富血小板血漿(PRP)。PRP于3000 rpm/min離心10分鐘，棄上清得血小板固體。加入生理鹽水清洗血小板，用滴管將血小板吹打均勻后，3000 rpm/min離心10分鐘，棄上清保留固體。再重復(fù)清洗2～3次，得到未活化的血小板。再次加入生理鹽水稀釋，調(diào)整血小板計(jì)數(shù)濃度為1×105個(gè)/mL。

(2)取上述血小板懸液400μL，加入100μL生理鹽水，孵育30 分鐘(37℃)，得到未活化血小板。吸取所制得的樣品溶液100μL依次滴到云母片和硅片上，5分鐘后，用濾紙吸掉部分溶液，每個(gè)樣品上滴30μL3%戊二醛溶液，固定10分鐘，然后加100μL超純水重復(fù)洗滌云母片和硅片3次，晾干后得樣1和樣2，用雙面膠粘在樣品碟上等待檢測(cè)。

(3)取第1步所得血小板懸液400μL，孵育30分鐘(37℃)，加入100μL 3%戊二醛溶液，4℃固定2h，3000 rpm/min離心10分鐘，棄上清繼續(xù)超純水清洗3次，3000 rpm/min離心10分鐘得固定后的血小板固體。加入500μL超純水，滴管吹打均勻后，吸取溶液100μL依次滴在云母片和硅片上，晾干得樣3和樣4，用雙面膠粘在樣品碟上等待檢測(cè)。

(4)采用Bruker multimode 8原子力顯微鏡，探針SNL-A，接觸模式成像，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 樣1～樣4的AFM成像圖圖A～D依次為樣1～樣4的AFM成像圖

首先采用了先點(diǎn)樣后固定的方法，分別以云母和硅片為基底，制得樣1和樣2，得到了成像圖A和B。為排除血小板在定容、點(diǎn)樣等過(guò)程中受激，我們又嘗試先固定后點(diǎn)樣的方法，分別以云母和硅片為基底，制得樣3和樣4，得到了成像圖C和D。

由圖1可見(jiàn)，選用上述哪種制樣方法，并分別選用云母片和硅片兩種基底，在所測(cè)得的AFM成像圖中，單個(gè)血小板都呈扁平圓盤狀, 表面比較平滑，無(wú)偽足。由此推斷，兩種制樣方法，兩種基底，都可以用來(lái)完成血小板制樣，得到很好的形貌圖，給血小板的研究提供確鑿的影像學(xué)支持。

3 制樣過(guò)程中的其他影響因素

(1)循環(huán)血液中血小板基本處于靜息狀態(tài)，在制樣過(guò)程中，因各種因素的作用，血小板很容易受到刺激而成為活化血小板發(fā)揮聚集作用[13]。因此整個(gè)血小板的制樣過(guò)程中動(dòng)作必須要輕柔，防止過(guò)度刺激活化血小板。圖2為過(guò)度活化的血小板，在AFM下血小板大多呈聚集狀態(tài), 彼此間大多有偽足相連[14]。

圖2 過(guò)度活化的血小板成像

圖3 樣品表面被破壞的AFM成像

(2)AFM測(cè)樣時(shí)，基底表面需要非常平整，因此在點(diǎn)樣時(shí)要一次性把溶液均勻鋪滿整個(gè)基底，避免用槍頭在樣品表面劃來(lái)劃去，圖3深色區(qū)域?yàn)闃岊^劃過(guò)的痕跡，因樣品表面不平整，直接影響血小板的成像。

圖3 樣品表面被破壞的AFM成像

(3)實(shí)驗(yàn)取血中所用到的離心管、槍頭和吸管必須提前做好硅烷化處理[15]，如果硅烷化不完整，或者動(dòng)作不夠輕柔，會(huì)引起紅細(xì)胞破裂發(fā)生溶血現(xiàn)象，圖4為溶血后的AFM成像，圖中箭頭所示為血小板成像，效果與圖1相近，但可以清晰看到視野中布滿了大量的紅細(xì)胞的碎片，嚴(yán)重影響血小板的AFM成像圖。

圖4 溶血后的AFM成像

(4)實(shí)驗(yàn)中需要將云母片和硅片粘在樣品碟上，所選用的膠一定不能是水溶性的，也不能遇水膨脹，否則會(huì)導(dǎo)致Z Piezo一直向Retracted方向飄，見(jiàn)圖5，無(wú)法正常成像。

圖5 Z Piezo向Retracted方向飄移

(5)云母在揭掉時(shí)一定要一整層揭掉，透明膠帶粘滿云母表面，一定要檢查是否是整層，如果撕裂或者不平整，見(jiàn)圖6，樣品不能均勻分布在云母表面，直接影響最后的成像效果。另外，基底不能太薄，如果選用云母為基底，太薄的云母會(huì)導(dǎo)致聚焦困難，同樣會(huì)影響最終的成像效果。

圖6 撕裂的云母表面

(6)需要注意探針的清潔，如果探針不小心被污染，可以用乙醇/異丙醇(EtOH/IPA)浸泡探針，紫外燈照射，必要時(shí)用plasma處理[16]。

4 結(jié)論

循環(huán)血液中血小板基本處于靜息狀態(tài)，在各種理化和生物因子的作用下，血小板受到刺激而成為活化血小板發(fā)揮聚集作用。血小板在采集、保存過(guò)程中受多種因素影響，其代謝和生理活性很容易發(fā)生改變和活化。

為了提高血小板制樣的成功率，本文總結(jié)了不同的制樣方法及實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的影響因素。分別選用云母片和硅片基底，首先采用了先點(diǎn)樣后固定的制樣方法，為排除血小板在定容、點(diǎn)樣等過(guò)程中受刺激，又嘗試先固定后點(diǎn)樣的制樣方法。成像結(jié)果顯示，無(wú)論是選用先點(diǎn)樣后固定的方法，還是選用先固定后點(diǎn)樣的方法，都可以得到很好的血小板成像圖，因此這兩種方法都可以用來(lái)完成血小板的制樣。但在血小板的制樣過(guò)程中，還有很多關(guān)鍵因素會(huì)影響最后成像，如硅烷化不完整引起的溶血，動(dòng)作不夠輕柔引起的血小板過(guò)度活化，操作不規(guī)范引起的樣品表面不平整等。因此在AFM對(duì)血小板成像的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)該盡量避免上述操作不當(dāng)影響最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為血小板的研究提供有力的影像學(xué)支持。