(1. 國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京，102205；2. 防化研究院分析化學實驗室，北京，102205)

芥子氣(sulfur mustard, mustard gas, SM, MG, HD)是糜爛性毒劑最典型代表，學名為2, 2’-二氯二乙硫醚。HD作為化學戰(zhàn)劑首先部署于第一次世界大戰(zhàn)，大約有130萬的人受到芥子氣的損傷，傷亡率占化學毒劑總傷亡人數(shù)的 80%以上[1]。第二次世界大戰(zhàn)日本侵華期間，日軍廣泛對中國軍民施用了HD，造成了巨大傷亡。直到現(xiàn)在，在中國仍有大量的日本遺留化學武器，其中大部分是HD和芥路混合毒劑，據(jù)不完全統(tǒng)計這些日遺化武已經(jīng)使3000多名中國公民受到不同程度的傷害[2]。2003 年中國齊齊哈爾的“8·4”事件正是此類典型事件。此后，兩伊戰(zhàn)爭上也有HD施用的報道[3]。雖然化武公約嚴格禁止HD的生產(chǎn)、儲存和施用，但以往遺留在化學炮彈中的HD仍會時刻威脅人民的生命安全。因此，有必要建立和發(fā)展可靠的分析方法溯源性檢測和鑒定HD染毒，為指證HD的使用和改善HD染毒人員的醫(yī)療救治提供依據(jù)。與其它體內(nèi)代謝物相比，HD與蛋白質加合物更為穩(wěn)定、具有較長的半衰期，能夠在較長時間范圍內(nèi)檢測到這些加合物，成為HD中毒檢測的重要生物標志物。

1 HD概述與中毒機理

與神經(jīng)性毒劑相比，糜爛性毒劑HD的致死性相對較低。HD具強烈的細胞毒作用，能使人或動物皮膚產(chǎn)生紅斑、水皰、壞死，并能引起眼、呼吸道、消化道粘膜和組織損傷，出現(xiàn)程度不同的全身中毒，主要表現(xiàn)為造血系統(tǒng)和消化道粘膜等的損害[4]。雖然HD中毒機理尚未完全闡明，但普遍認為由于HD具兩個親電碳原子，是典型的雙功能烷基化試劑，進入體內(nèi)后能形成硫鎓正離子，生理條件下，硫鎓正離子通過SN1機制與體內(nèi)器官或組織中的多種化合物分子的親核性基團如氨基、巰基、羥基、羧基、磷酸基及咪唑基等反應，生成對應的烷基化產(chǎn)物，進而產(chǎn)生各種毒理效應，如破壞細胞正常的分裂繁殖；抑制酶的活性；使蛋白變性，導致細胞和組織壞死、潰爛等。而HD進入體內(nèi)后的水解代謝物硫二甘醇(TDG)和它的氧化產(chǎn)物硫二甘醇亞砜(TDGO)、一系列β-裂解酶代謝產(chǎn)物、HD與DNA在鳥嘌呤N7, O6位置上的加合物和在腺嘌呤N3位置上的加合物，HD與一些蛋白質的加合物已經(jīng)被作為偵檢臨床樣本中HD暴露的重要生物標志物，并且為醫(yī)學治療提供了可靠的信息。

2 水解產(chǎn)物、與谷胱甘肽加合物及其β-裂解產(chǎn)物為HD中毒生物標志物

HD進入體內(nèi)在生理條件下，迅速形成的硫鎓正離子中間體具強的電負性，能夠與水、谷胱甘肽等小分子親核試劑反應分別生成硫二甘醇(TDG)和HD-谷胱甘肽加合物(圖1)，后者再經(jīng)β-裂解酶作用生成β-裂解產(chǎn)物，這些代謝物均為HD中毒的重要生物標志物。

2.1 HD水解產(chǎn)物

由HD水解生成的TDG，可以通過氧化反應轉化生成硫二甘醇亞砜(TDGO)(圖1)。一直以來，由于TDG和TDGO少量存在于正常健康人的尿液中，它們作為確證HD中毒的生物標志物存在一定的爭議。然而，TDG和TDGO在正常人體內(nèi)的背景值極低，分別僅為0～1.0 ng/mL和2～8.0 ng/mL[5]，遭遇HD染毒的樣本中兩者的含量將顯著增加，研究證實，體內(nèi)TDG濃度高于2 ng/mL，TDGO濃度高于10 ng/mL，可初步認定為HD中毒。因此，它們常作為核查HD暴露的輔助性依據(jù)。此外，進入體內(nèi)的HD也有極少量發(fā)生氧化，生成HD亞砜(SMO，圖1)，該代謝產(chǎn)物被檢測存在于尿液、血液和分泌物中。SMO為非內(nèi)源性物質，被用作HD中毒的重要生物標志物。這些水解、氧化產(chǎn)物可在HD暴露后迅速出現(xiàn)在生物體液中，并于數(shù)日內(nèi)經(jīng)尿液排出體外。

圖1 HD在體內(nèi)代謝的4種主要途徑

TDG和TDGO的定量檢測，常通過衍生化制備，再由GC-MS/MS檢測，檢測限可達0.5 ng/mL。此外，近年來，LC-ESI-MS/MS也被發(fā)展用于檢測這些化合物，該類方法樣品制備簡單，無需復雜的衍生化過程，采用SRM模式，檢測限達0.05 ng/mL(SMO)、5.0 ng/mL(TDG)和0.5 ng/mL(TDGO)[6]。

2.2 HD-谷胱甘肽加合物及其β-裂解產(chǎn)物

谷胱甘肽(GSH)是人體內(nèi)具有活性的含有3個氨基酸的小分子肽類物質，HD與谷胱甘肽的加合位點為半胱氨酸上的巰基。HD-谷胱甘肽加合物經(jīng)γ-谷氨酰基轉肽酶和二肽酶酶解后游離出HD-半胱氨酸加合物，再由N-乙酰轉移酶轉化生成SBSNAE(圖1)。再經(jīng)β-裂解酶作用，生成一系列特征性的非內(nèi)源性的小分子標志物，被稱為“β-裂解產(chǎn)物”；主要為：1,1’-磺?；?2-甲亞磺?；?乙烷(SBMSE)和1-甲基亞磺?；?2-(2-甲巰基乙基磺?；?乙烷(MSMTESE)等(圖1)。此外，經(jīng)檢測，這些特征性代謝產(chǎn)物隨尿液排出體外，在體內(nèi)可停留約1周。

β-裂解產(chǎn)物的分析檢測手段主要是GC-MS或GC-MS/MS，然而，由于SBMSE和MSMTESE的熱穩(wěn)定性較差，分析前通常應用三氯化鈦等將其還原成單一的1,1’-磺?；?2-甲巰基)乙烷(SBMTE)，然后再進行檢測。Black等[8]和王穎等采用GC-PCI-MS檢測尿液中的β-裂解產(chǎn)物，檢測限分別為2 ng/mL和0.5 ng/mL。Young等[10]應用GC-MS/MS進行檢測，該方法具最高的靈敏度，尿樣中的β-裂解產(chǎn)物的檢測限可達0.038 ng/mL。然而，應用這些氣質聯(lián)用技術涉及到復雜的樣品制備步驟，一定程度上限制了其應用與推廣。為了獲得更簡便的檢測方法，LC-MS/MS定量檢測血液[6]、尿液中β-裂解產(chǎn)物的分析方法逐漸被建立和應用。該類方法無需還原反應等處理，只要簡單的制備即可直接進入LC-MS/MS分析。近來，一個高特異性、靈敏的檢測血漿中所有β-裂解產(chǎn)物和SBSNAE的方法被建立和考察，檢測限分別為0.01 ng/mL(SBMSE和MSMTESE)、0.05 ng/mL(SBMTE)和0.5 ng/mL(SBSNAE)，較Read等建立的LC-MS 或LC-MS/MS分析方法的靈敏度有較大的提高[6]。

對于尿液中HD代謝物的溯源檢測，雖然已有大量的液質和氣質檢測方法已經(jīng)被建立，但以上方法未見有一種單獨的方法能夠同時檢測HD在尿液中的水解代謝物、與谷胱甘肽的加合物及其β-裂解產(chǎn)物。然而，本實驗室Liu等通過固相萃取方法的改進，首次建立了一個單獨的可以同時定量檢測尿液中HD的4個代謝物液質分析方法，避免了以往需要多個分析方法才能完成此4個化合物檢測的問題[11]。

3 HD與蛋白質和核酸加合物作為HD中毒的生物標志物

HD進入體內(nèi)，除了與水、谷胱甘肽等小分子親核試劑反應外，還與DNA和蛋白質等大分子上的親核基團反應，生成相應的HD-DNA或HD-蛋白質加合物(圖1)。這些大分子加合物較為穩(wěn)定，在體內(nèi)可存在數(shù)月之久，因此它們已成為HD中毒溯源檢測的重要生物標志物。

3.1 HD-核酸加合物

HD中毒引發(fā)的細胞毒性被認為主要由HD烷基化DNA所致，烷基化的DNA直接使遺傳信息無法準確復制，進而發(fā)生錯誤的轉錄與翻譯，最終表現(xiàn)出機體的損傷。由HD介導的DNA烷基化位點發(fā)生在脫氧鳥嘌呤(G)的N7位，產(chǎn)物為N7-(2-羥乙基硫代乙基)鳥嘌呤(N7-HETEG)；脫氧腺嘌呤(A)的N3位，產(chǎn)物為N3-(2-羥乙基硫代乙基)腺嘌呤(N3-HETEA)；脫氧鳥嘌呤(G)的O6位，產(chǎn)物為O6-(2-羥乙基硫代乙基)鳥嘌呤(O6-HETEG)(圖2)。此外，一分子的HD與兩個鳥嘌呤在N7位上發(fā)生鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)，產(chǎn)物為雙(鳥嘌呤-7)衍生物(Bis-G)(圖2)。這些位點的烷基化具明顯的傾向性，經(jīng)測定，N7-HETEG含量最高，約占DNA總加合物的61%，N3-HETEA和Bis-G各約占17%，而O6-HETEG僅占總加合物的0.1%。

圖2 4個HD-DNA加合物的結構式

基于此，早期的檢測方法主要集中于N7-HETEG，方法主要為32P 后標記法、免疫檢測法和質譜分析。前兩者雖然具高的特異性和靈敏度，但操作步驟相對復雜且定量的準確度不高。質譜法可以彌補這方法的缺點，因此檢測獲得了越來越多的重視。由于N7-HETEG的極性強，需先采用五氟苯甲酰溴或雙三甲基硅基三氟乙酰胺等對其進行衍生化，再進入GC-MS檢測。但該方法樣品制備過程仍過于復雜，衍生化條件過于苛刻，因此應用上受到了很大限制。相比之下，LC-MS/MS方法無需衍生化即可直接檢測，相關的方法也獲得了發(fā)展和應用。Fidder等[12]將樣品經(jīng)SPE簡單分離凈化后，直接進入LC-MS/MS 分析，在HD染毒豚鼠尿液中檢測到了N7-HETEG，檢測限為0.2 ng/ml。Wei等[13]建立了專門適用于人血液中N7-HETEG加合物的檢測方法，血液中的DNA經(jīng)分離、酸水解，再進入LC-MS/MS定量分析，方法檢測限為0.33 ng/mL，應用該方法能夠在染毒濃度為312 ng/ml HD的全血中，檢測到N7-HETEG。Batal等[14]主要分析了SM處理的小牛胸腺DNA和人白血病單核細胞中最豐富的3種DNA加合物N7-HETEG、N3-HETEA和BisG，該方法基于外部校準曲線的使用，后續(xù)研究集中于DNA加合物在內(nèi)臟分布情況。Zhang等建立并驗證了一種氘代同位素稀釋UHPLC-MS/MS同時定量N7-HETEG、N3-HETEA、Bis-G、和O6-HETEG的方法，該方法更為簡便、靈敏，4個分析物的檢測限分別為0.01、0.11、0.04和0.002 fmol，此外該課題組分析發(fā)現(xiàn)脂肪細胞系和脂肪組織中的DNA加合物水平遠高于其他組織，一定程度上表明HD可能易在富脂環(huán)境富集[7]。Zubel[15]課題組以15N/13C的HD-DNA加合物標樣為內(nèi)標，同樣利用同位素稀釋超高液相色譜-質譜技術，在多種樣本中定量分析了HETEG、HETEA及BisG與芥子氣染毒劑量和染毒時間的關系。。

3.2 HD-蛋白質加合物

與其它代謝產(chǎn)物相比，HD與蛋白質加合物更為穩(wěn)定、具有較長的半衰期，能夠在較長時間范圍內(nèi)檢測到這些加合物[16, 17]，是HD中毒長期溯源性檢測的重要生物標志物。雖然，在體內(nèi)HD能夠使多種蛋白質上的親核氨基酸殘基發(fā)生烷基化，但其中作為生物標志物被認為最重要的是HD與血紅蛋白N-末端纈氨酸反應，生成的HD-血紅蛋白烷基化加合物；以及與血清白蛋白第34位的半胱氨酸反應，生成的HD-白蛋白烷基化加合物(圖3)；主要是由于這兩種蛋白加合物含量高、易于分離和檢測。

HD與血紅蛋白N-末端Val殘基形成的加合物最為穩(wěn)定，能夠在體內(nèi)存在長約120天。HD-血紅蛋白加合物的檢測方法主要是使用Edman降解法結合氣相色譜 (GC)-NICI-MS分析鑒定產(chǎn)生的S-羥乙基硫乙基(S-HETE)-Val加合物。HD-血紅蛋白加合物經(jīng)Edman降解后，生成N-末端Val加合物，再由七氟丁酸酐或七氟丁酰咪唑衍生化后，用NCI-GC/MS分析衍生化產(chǎn)物，檢測限可達0.1 μmol/L。該方法被應用于實際HD染毒樣品的溯源性檢測，測定HD 染毒22～26天的伊朗傷員全血樣本，均檢出了(S-HETE)-Val加合物。

圖3 HD與人血清白蛋白第34位Cys殘基加合反應過程

HD與人血清白蛋白(ALB)第34位半胱氨酸殘基，生成穩(wěn)定的S-羥乙基硫乙基([S-HETE])-ALB加合物在體內(nèi)的半衰期為20～25天。該HD-ALB加合物的檢測方法主要為蛋白酶解結合LC-ESI-MS-MS分析，方法基于應用鏈酶蛋白酶酶解[S-HETE]-ALB加合物，轉換生成分子量較小、易于質子化的三肽加合物“[S-HETE]-CPF”，再進行LC-ESI-MS-MS的檢測分析[22]。以d8-HD作為內(nèi)標，分析定量HD暴露血漿中[S-HETE]-CPF三肽加合物的定量方法已經(jīng)被建立，應用該方法在真實HD暴露樣本中檢測出[S-HETE]-ALB加合物，有效地確證了HD樣本的染毒。最近，Pantazides等[25]建立了一個改進的定量HD-ALB加合物方法，該方法具簡化的樣品制備步驟，使用少量的血液樣本，選擇蛋白酶K酶解[S-HETE]-ALB加合物，解決了以往不同批次鏈酶蛋白酶酶解產(chǎn)生[S-HETE]-CPF三肽加合物的量變異性較大的問題。但該方法僅能測定[S-HETE]-CPF加合物的量，而非暴露HD的濃度，測定結果無法直接給出人員HD中毒程度的信息；本實驗室Liu等通過引入HD模擬劑作為內(nèi)標，建立了血漿中HD-ALB加合物的定量檢測方法，實現(xiàn)了HD染毒濃度的直接測定[26]。

4 結論

鑒于糜爛性毒劑HD在生物醫(yī)學樣本中溯源性鑒定需求，大量的HD中毒溯源生物標志物分析檢測方法被開發(fā)和建立，其中基于質譜分析的技術在生物標志物的檢測鑒定領域具有明顯優(yōu)勢，不足是仍要結合復雜的樣品前處理程序才能獲得滿意的靈敏度，分析檢測周期較長，無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測；此外，對于大量中毒樣本，不能同時處理和分析。因此，今后建立適合高通量、自動化分析HD中毒溯源生物標志物檢測方法，建立健全相應的高通量設備或裝備體系；以及結合分子識別與光學檢測，設計適于現(xiàn)場檢測的芯片等，實現(xiàn)生物醫(yī)學樣本中毒劑與蛋白質加合物在現(xiàn)場的快速、準確、特異性檢測，將是未來應用和發(fā)展的趨勢。