李 寧，姚新苗，龔怡辰

(1浙江康復(fù)醫(yī)療中心，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院·浙江 杭州 310000；2浙江省中山醫(yī)院·浙江 杭州 310000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加，易于發(fā)生骨折的全身代謝性疾病。絕經(jīng)后婦女及老年人為主要發(fā)病群體[1]。骨質(zhì)疏松患者存在著骨生成與骨丟失的不平衡，這種不平衡與成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)，成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均來(lái)源于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；因此骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞或者破骨細(xì)胞分化的信號(hào)通路是目前研究的重點(diǎn)，其中包括多種熱門的信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路等[2],本院姚新苗教授研發(fā)的益骨湯臨床應(yīng)用能明顯改善OP患者的臨床癥狀，降低骨折的發(fā)生率[3]。本研究通過(guò)Wistar大鼠切除卵巢復(fù)制OP模型，檢測(cè)股骨骨組織中PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的變化，在細(xì)胞分子層面探究益骨湯防治OP的具體作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡健康清潔級(jí)雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(195±10)g,Wistar大鼠均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0034，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度在(22±2) ℃，濕度(50±8)%，光照與黑暗時(shí)間每12 h交替，自由飲水、攝食，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以顆粒及水果混合飼料飼養(yǎng)，喂養(yǎng)10周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 益骨湯含淫羊藿、補(bǔ)骨脂、生地、丹參、山藥及骨碎補(bǔ)6味中草藥，均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院中藥房提供，煎藥機(jī)配制成2 g·mL-1的提取液。戊酸雌二醇片：由拜耳醫(yī)藥保健有限公司提供。

1.3 試劑及儀器 血清BALP、OC和PINP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒：上海科順生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒：杭州寶賽生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；總蛋白提取試劑盒：南京凱基生物有限公司；BCA蛋白定量試劑盒：天根生物科技有限公司。Agilent Stratagene Mx3005P定量PCR儀：美國(guó)安捷倫公司；Tanon GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；DPX-L型雙能骨密度儀：美國(guó)Lunar公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備、分組及給藥 按照數(shù)字隨機(jī)表法將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、益骨湯組及戊酸雌二醇組，每組15只。腹腔注射水合氯醛麻醉后，模型組、益骨湯組及雌二醇組大鼠均切除雙側(cè)卵巢，建模成功率為100%，無(wú)大鼠死亡發(fā)生。正常組大鼠未做任何處理，各組大鼠均以飼料喂養(yǎng)12周，從第13周開(kāi)始給藥，正常組不做任何處理，模型組給予生理鹽水10 mL·kg-1灌胃，益骨湯組以益骨湯提取液37.5 g/kg灌胃，雌二醇組按照0.36 mg/kg給予灌胃，均每天灌胃1 次,共喂養(yǎng)10周。

2.2 觀察指標(biāo)及測(cè)定

2.2.1 骨密度(BMD)檢測(cè) 各組大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉成功后將各組大鼠固定于BMD測(cè)定臺(tái)上，將大鼠拉直后雙能骨密度儀測(cè)定每只大鼠脊柱的BMD。

2.2.2 血清BALP、OC和PINP含量檢測(cè) 大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉成功后各組大鼠心臟采血，室溫放置1～2 h并且3 500 r/min離心10 min后收集血清，用血清BALP、OC和PINP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、測(cè)定血清BALP、OC和PINP含量，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明要求進(jìn)行。

2.2.3 PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 取2.2.2各組大鼠右側(cè)股骨，剔除掉軟組織，生理鹽水沖洗后，放入液氮中，重復(fù)3次后放入-80 ℃中保存?zhèn)溆?。Trizol一步法提取各組大鼠股骨骨組織中總RNA，熒光定量PCR按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，以β-actin為內(nèi)參，獲得各組骨組織中PI3K、AKT、GSK-3β的相對(duì)表達(dá)量。

2.2.4 PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的 Western blot檢測(cè) 取2.2.2各組大鼠右股骨粉碎后，取骨組織1 g,加入含有RIPA的組織裂解液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑(PMSF),蛋白定量后放入沸水里約15 min,每個(gè)樣品取50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂奶粉封閉1 h，一抗在4 ℃下過(guò)夜，二抗在室溫的情況下孵育1 h，加入ECL后曝光，使用圖像處理系統(tǒng)掃描并計(jì)算每條帶的吸光度值，將其與內(nèi)參條帶吸光度值的比值代表各組股骨骨組織中PI3K、AKT、P-AKt、GSK-3β的蛋白表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)，采用LSD法，方差不齊性時(shí)，采用Dunnettt′sT3法，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠脊柱BMD及血清BALP、OC、PINP含量比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠脊柱BMD及血清BALP、OC、PINP含量的比較

3.2 各組大鼠骨組織PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的比較 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠骨組織PI3K、AKT、GSK-3β mRNA 表達(dá)的比較

3.3 各組大鼠骨組織PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組大鼠骨組織PI3K、AKT、GSK-3β蛋白 表達(dá)的比較

圖1 各組大鼠PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果

4 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)屬于中醫(yī)“骨痹”“骨痿”范疇，其發(fā)病機(jī)制與腎有關(guān)，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松的發(fā)生與腎、脾、瘀關(guān)系密切[4]。腎虛是根本，脾胃虛弱是其發(fā)病的重要因素。中醫(yī)理論認(rèn)為,腎藏精,主骨,生精,為先天之本;脾主運(yùn)化,為后天之本,是氣血生化之源, 血瘀是病理產(chǎn)物，又屬于致病因素，補(bǔ)腎健脾、活血化瘀是其主要的治療原則。姚新苗教授一直致力于骨質(zhì)疏松癥的臨床研究，通過(guò)中醫(yī)經(jīng)典理論，研發(fā)出經(jīng)典方劑“益骨湯”，該方由補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、懷山藥、生地及丹參組成，方中以補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)壯筋骨為主；懷山藥健脾，生地補(bǔ)腎益陰，丹參活血化瘀。臨床研究發(fā)現(xiàn)，益骨湯能有效地提高老年骨質(zhì)疏松患者的腰椎骨密度，減輕疼痛，抑制骨吸收，改善患者的臨床癥狀[3]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，益骨湯能明顯提高去勢(shì)大鼠血清性激素水平，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性[5]，提高大鼠的骨密度水平，進(jìn)而提高大鼠的生物力學(xué)性能，并且可以通過(guò)降低大鼠血清炎性因子[6]的表達(dá)達(dá)到緩解疼痛等臨床癥狀的效果。

骨重建過(guò)程主要由成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞共同參與完成[7]，骨質(zhì)疏松的形成機(jī)制目前主要是骨重建負(fù)平衡導(dǎo)致，骨重建過(guò)程中骨吸收大于骨形成造成了骨質(zhì)疏松[8]。成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞共同起源予骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，因此，通過(guò)誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為了現(xiàn)在研究的重點(diǎn)[9]。目前研究表明，多種信號(hào)通路可影響B(tài)MSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，如經(jīng)典的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路[10]、TGF-β/BMP-2 信號(hào)通路[11]及PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路等。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，益骨湯可以通過(guò)經(jīng)典Wnt 兩條信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt、BMP2、β-catenin、Runx2、OSX等因子[12]實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)骨形成，防治骨質(zhì)疏松[13-15]。除Wnt/β-catenin信號(hào)通路外，PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路一直以來(lái)都是研究細(xì)胞增殖與凋亡的重點(diǎn)[16]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，由各種催化亞基組成，細(xì)胞外信號(hào)和活化的Ras蛋白質(zhì)受體相結(jié)合，激活PI3K,PI3K磷酸化PIP2,使PIP2轉(zhuǎn)換成PIP3,PIP3與AKT的PH結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使AKT募集到細(xì)胞膜上，使AKT 的第 308 位酶氨酸磷酸化[17]，從而激活A(yù)KT(p-AKt)，GSK-3β是其該信號(hào)通路的下游因子，是被發(fā)現(xiàn)的 AKT 作用的底物， AKT 可使 GSK-3β第9位絲氨酸磷酸化，降低 GSK-3β的磷酸化水平，增強(qiáng)堿性磷酸酶(ALP)活性、促進(jìn)Ca2+沉積和上調(diào)OCN、Runx2的表達(dá)水平，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果表明，益骨湯組及雌二醇組均能提高去勢(shì)大鼠脊柱BMD，與模型組相比具有明顯差異性(P<0.05)，模型組血清BALP、OC和PINP的含量較正常組明顯降低(P<0.05)，益骨湯組及雌二醇組血清BALP、OC和PINP的含量較模型組明顯升高(P<0.05)，益骨湯組及雌二醇組均能提高去勢(shì)大鼠PI3K的基因及蛋白表達(dá)水平及P-AKt蛋白的表達(dá)水平并降低 GSK-3β基因及蛋白的表達(dá)水平，與模型組相比具有明顯差異性(P<0.05)，與正常組相比無(wú)明顯差異性(P>0.05)，兩組對(duì)AKT基因及蛋白的表達(dá)水平較正常組及模型組無(wú)明顯差異(P>0.05)。表明益骨湯可以增強(qiáng)去勢(shì)大鼠骨密度，可能是通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。