馬永力，陳紅梅，方新華，王鑫昱，葛衛(wèi)紅

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院,杭州市中醫(yī)院·浙江 杭州 310053；2杭州市丁橋醫(yī)院·浙江 杭州 310053；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)·浙江 杭州 310053)

衢枳殼自2016年8月被2015版《浙江省炮制規(guī)范》收錄以后，在浙江省范圍內(nèi)，衢枳殼逐漸替代其他產(chǎn)區(qū)的枳殼在臨床上被大量使用。目前枳殼主流商品種類主要有川枳殼、江枳殼、湘枳殼和浙產(chǎn)衢枳殼四大類[1]，不同產(chǎn)地枳殼價(jià)格差異較大，其中衢枳殼最便宜。雖然衢枳殼各項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目均符合2015版《中國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，但是衢枳殼能否在不降低甚至提高枳殼質(zhì)量及臨床療效的前提下作為價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的品種大量使用，還需要比較衢枳殼與其他主流產(chǎn)區(qū)枳殼的主要藥理作用。本研究基于枳殼理氣消脹功效，以大鼠的體質(zhì)量、24 h代謝值、小腸推薦率、胃殘留率及血漿和組織GAS、MTL、SS含量為指標(biāo)，比較衢枳殼與其他三大主產(chǎn)區(qū)枳殼的理氣作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取健康SPF級(jí)雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量(250±20)g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0006。于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)許可證號(hào)SYXK(浙)2018-0012。

1.2 藥物 分別從浙江常山、浙江龍游、浙江衢州市柯城、湖南益陽(yáng)、江西新干、江西樟樹、重慶江津購(gòu)得18個(gè)批次枳殼藥材，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠錢敏主管中藥師鑒定為蕓香科植物常山胡柚Citruschangshan-huyouY.B.Chang、酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥幼果，選取含量符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定的各主產(chǎn)區(qū)枳殼0.3 kg，打成粗粉，加入1 000 mL去離子水，浸泡1 h，加熱回流2次，兩次過濾后合并濾液，減壓濃縮至300 mL，最后得到1 g/mL的枳殼提取液，放置在冰箱保存?zhèn)溆?。多潘立酮片：西安揚(yáng)森制藥有限公司，批號(hào)：JKJI1697，碾碎并制備成1 g/L的混懸液。

1.3 試劑與儀器 大鼠GAS、MTL、SS酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號(hào)：Ml203981、Ml003079、Ml003102)：蘇州卡爾文生物科技有限公司。 C16000全自動(dòng)生化檢測(cè)儀：雅培公司；DM3000正置熒光顯微鏡：Leica；AVANTI J-26 XP離心機(jī)：美國(guó)Bechmen公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、模型制備及給藥處理 56只SD大鼠代謝籠法記錄每組大鼠24 h飲食量和飲水量，然后根據(jù)飲食量與體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、衢枳殼組、江枳殼組、川枳殼組、湘枳殼組，每組8只。正常對(duì)照組正常喂養(yǎng)14 d，余下6組按“不規(guī)則喂養(yǎng)法配合夾尾刺激法”[2]造模14 d：將大鼠正常喂水，單日喂食，雙日禁食[3]；每日早晨9:00稱量大鼠的體質(zhì)量并做記錄，并用長(zhǎng)海綿鉗夾大鼠尾巴末端1/3處，以令其尖叫掙扎但不破皮為度，使它發(fā)怒并和其他大鼠廝打(若有抓傷，予碘伏消毒傷口，以防感染)，每次刺激30 min，每日9:00與15:00各刺激1次，連續(xù)刺激14 d[3]。成模標(biāo)準(zhǔn)造模大鼠24 h飲食量、飲水量、尿量顯著低于正常組。造模結(jié)束后，各組大鼠均正常喂養(yǎng)。正常對(duì)照組及模型組大鼠給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，陽(yáng)性組給予多潘立酮3 mg/kg灌胃，衢枳殼組、江枳殼組、川枳殼組、湘枳殼組均以4 g/kg劑量灌胃；每日灌胃1次，連續(xù)14 d。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.2.1 一般狀態(tài) 每日觀察各組大鼠體質(zhì)量、毛發(fā)狀態(tài)、動(dòng)作敏捷程度、精神狀態(tài)、糞便形態(tài)等情況。

2.2.2 代謝指標(biāo) 給藥結(jié)束時(shí)測(cè)定各組大鼠24 h進(jìn)食量、24 h飲水量和24 h排尿量，并記錄結(jié)果。

2.2.3 小腸推進(jìn)率、胃排空率測(cè)定 末次給藥后禁食、不禁水12 h，以1.1 g/mL的面糊給大鼠灌胃(10 mL/kg)，灌胃面糊 30 min后，麻醉大鼠，結(jié)扎胃賁門和幽門，取胃竇和小腸，計(jì)算胃排空率及小腸推進(jìn)率。

2.2.4 大鼠血漿GAS、MTL、SS含量測(cè)定 末次給藥后禁食、不禁水12 h，麻醉大鼠，大鼠腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心15 min，分離血漿，置于-80 ℃冰箱備用。ELISA檢測(cè)血漿GAS、MTL、SS含量。

2.2.5 胃竇組織病理觀察 取各組大鼠胃竇組織置入4%多聚甲醛溶液中，樣本經(jīng)石蠟包埋后，切成4μm的切片，做常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組大鼠胃竇組織病理變化情況。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài)變化 與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，衢枳殼組、江枳殼組、川枳殼組、湘枳殼組與多潘立酮組大鼠體質(zhì)量均顯著增加，其中湘枳殼組大鼠體質(zhì)量增加極顯著(P<0.01)，多潘立酮組、衢枳殼組、江枳殼組、川枳殼組增加顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較

在造模期間，模型組大鼠毛發(fā)光亮平滑，動(dòng)作敏捷，精神狀態(tài)良好，糞便狀態(tài)為正常的顆粒狀。與正常組大鼠相比，造模組大鼠的毛發(fā)油膩糟亂，精神較為萎靡，易怒，排便減少且糞便質(zhì)地軟，形狀不規(guī)則。與模型組大鼠相比，各給藥組大鼠均有改善；其中陽(yáng)性藥組效果優(yōu)于衢枳殼組，衢枳殼組效果略優(yōu)于其他3組。

3.2 各組大鼠代謝指標(biāo)變化情況 見表2。

表2 各組大鼠飲水量、攝食量、尿量的比較

3.3 各組大鼠小腸推進(jìn)率、胃排空率測(cè)定結(jié)果 見表3。

表3 各組大鼠小腸推進(jìn)率、胃排空率測(cè)定結(jié)果比較

3.4 各組大鼠血漿GAS、MTL、SS 含量ELISA檢測(cè)結(jié)果 見表4。

表4 各組大鼠血漿GAS、MTL、SS含量比較

3.5 各組大鼠胃竇組織病理觀察 HE染色結(jié)果可見，各組大鼠胃竇無明顯病理變化，未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性損傷。染色后胃黏膜呈粉紅色， 胃黏膜無腺體萎

縮，僅模型組有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。胃肌層無明顯病理變化。

4 討論

功能性消化不良(FD)是常見的消化系統(tǒng)功能性疾病,其臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的上腹脹、上腹痛、早飽、噯氣等。古代文獻(xiàn)及現(xiàn)代藥理研究均證實(shí)枳殼對(duì)FD有顯著的治療作用。枳殼對(duì)胃腸平滑肌呈雙向調(diào)節(jié)作用，既能夠興奮胃腸，增強(qiáng)腸胃蠕動(dòng)，又能夠降低胃腸平滑肌張力，具有解痙作用[4]。許多權(quán)威專家認(rèn)為FD的基本病機(jī)為氣機(jī)升降失常，臨床上應(yīng)將調(diào)暢氣機(jī)作為治療FD的基本治則，實(shí)際臨床應(yīng)用中枳殼成為治療FD的主要藥物[5-7]。官揚(yáng)、祝婧等[8-11]實(shí)驗(yàn)亦證明枳殼對(duì)FD、脾虛型胃腸動(dòng)力障礙、功能性便秘模型大鼠均有顯著改善作用。

FD動(dòng)物模型要有相應(yīng)的“證”，且沒有器質(zhì)性損傷，故FD動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模方法眾多。典型的造模方法有苦寒法、飲食不節(jié)和勞倦過度法、偏食法、飲食失節(jié)法、利血平法、耗氣破氣法、耗氣破氣加飲食失節(jié)法、模擬情志因素法等[12]。多因素復(fù)合制作的動(dòng)物模型,以疾病模型為基礎(chǔ)，相對(duì)可靠、客觀，又額外施加中醫(yī)病因干預(yù)因素，使造模成功的幾率大大提升，同時(shí)模擬人體發(fā)病病因復(fù)雜的特點(diǎn),更加符合中醫(yī)病因病機(jī)理論[13]。在中醫(yī)學(xué)中，F(xiàn)D多為脾虛肝郁證型，改變大鼠正常飲食節(jié)律，導(dǎo)致其脾胃虛弱，脾氣不運(yùn)，又因用夾尾法刺激致其肝郁氣滯，進(jìn)而克制脾土，故出現(xiàn)飲食不佳，大便稀溏，氣味臭穢刺鼻，性情暴躁，易被激惹等癥狀，表示造模成功[14]。由于 FD 的發(fā)生不僅是飲食不當(dāng)這一單因素引起，還與患者的情志，精神狀態(tài)等多因素有關(guān)，故“不規(guī)則喂養(yǎng)法配合夾尾刺激法”聯(lián)合建立 FD 大鼠模型較單一因素更符合臨床[14]。

本研究顯示，與正常組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量、24 h飲水量與攝食量、胃排空率及小腸推進(jìn)率、血漿GAS、MTL含量明顯降低，SS含量明顯升高。與模型組比較，經(jīng)4組枳殼干預(yù)后，各給組大鼠的體質(zhì)量、24 h飲水量與攝食量、胃排空率及小腸推進(jìn)率、血漿GAS、MTL含量明顯提升，血漿SS含量明顯降低。衢枳殼組大鼠的胃排空率、小腸推進(jìn)率及一般情況優(yōu)于江枳殼組、川枳殼組與湘枳殼組大鼠；江枳殼組、川枳殼組與湘枳殼組各指標(biāo)比較沒有顯著性差異。

綜上所述，四大產(chǎn)區(qū)枳殼對(duì)FD模型大鼠均有理氣作用，其中衢枳殼對(duì)FD大鼠的理氣作用優(yōu)于江枳殼、川枳殼與湘枳殼；江枳殼、川枳殼與湘枳殼理氣作用沒有顯著性差異。衢枳殼作為浙江產(chǎn)道地藥材，不僅價(jià)格便宜，而且具有良好的理氣作用，可以作為作為價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的枳殼品種大力推廣使用。