孫春玲 ， 王一鳴 ， 齊曉新 ， 馮 磊 ， 楊應(yīng)春 ， 李華濤

(1.青島森林野生動物世界公園有限公司 ， 山東 青島 266500 ； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

小熊貓(Ailurusfulgens)屬于國家Ⅱ級重點保護(hù)動物，被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》[1-2]。小熊貓在分類、生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域具有十分重要的研究價值，也是動物園里具有很高觀賞價值的野生動物[3]，因其圈養(yǎng)數(shù)量越來越多，受病毒、細(xì)菌、營養(yǎng)、外傷等致死的病例也在不斷增加[4]。大葉性肺炎(Lobar pneumonia，LP)又稱為格魯布氏肺炎或纖維素性肺炎，是由細(xì)菌、病毒等病原微生物引起，呈大葉性分布的肺部急性炎癥，以肺泡內(nèi)纖維蛋白滲出為主要特征。小熊貓大葉性肺炎在臨床上并不常見，但其是對小熊貓危害極大的內(nèi)科病之一，發(fā)病急，可引起肺臟實質(zhì)性變化，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。本試驗對1例小熊貓大葉性肺炎死亡病例進(jìn)行了病理診斷與分析，報告如下。

1 病例情況

2019年3月，青島森林野生動物世界1只體重3.6 kg的2歲雌性小熊貓出現(xiàn)精神萎靡、鼻鏡干燥、咳嗽、呼吸困難、行走無力、食欲廢絕等癥狀。發(fā)病第1天使用阿莫西林克拉維酸鉀肌內(nèi)注射治療，效果不佳，患病小熊貓趴臥不動，抓捕無反抗能力。第2天開始使用阿莫西林克拉維酸鉀和鹽酸多西環(huán)素、地塞米松霧化，并采用強心、營養(yǎng)、抑制滲出、調(diào)整酸堿失衡等措施補液治療。第4天由于留置針被其自行拔出，未能持續(xù)輸液，該小熊貓于發(fā)病第7天死亡。

2 診斷

2.1 臨床檢查 患病小熊貓體溫高達(dá)39.9 ℃，視診呼吸急促，以腹式呼吸為主，頻繁咳嗽，咳痰為鐵銹色，有時劇烈，伴有呼嚕聲，流褐色鼻液；叩診胸部有疼痛反應(yīng)，成廣泛性濁音；聽診時呼吸音加粗加重，出現(xiàn)大面積濕啰音。

2.2 實驗室檢查

2.2.1 血液學(xué)檢查 患病小熊貓血常規(guī)采用邁瑞B(yǎng)C-2800檢測，結(jié)果顯示：白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞增多，紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量均下降；生化采用富士NX500iVC檢測，結(jié)果顯示：肌酐、尿素氮指標(biāo)大幅度升高，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)大幅度升高，肝腎功能受損嚴(yán)重。

2.2.2 膠體金快速診斷 使用韓國安捷犬瘟熱、犬細(xì)小病毒快速診斷試紙，采集患病小熊貓口鼻眼分泌物和糞便，分別加入配套稀釋液中，混勻靜置后吸取上清液加入試紙條加樣孔中1～2滴，10 min后犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)和犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)檢測結(jié)果均顯示為陰性。

2.2.3 影像學(xué)檢查 采用X線檢查方法對患病小熊貓仰臥位(圖1A)、側(cè)臥位(圖1B)的胸部進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示：患病小熊貓肺部密度不均勻且肺部紋理增粗(圖1a)，右肺前葉肺泡消失實變(圖1b)，支氣管呈空氣支氣管征，右肺肺葉間裂隙，雙肺后緣橫膈間隙不透X線影像(圖1c)，側(cè)位見戒指征、鐵軌征(圖1d)。

圖1 小熊貓胸部X線檢查結(jié)果Fig.1 X-ray examination results of Ailurus fulgens chestA：仰臥位； B：側(cè)臥位； a：紋理增粗； b：實變； c：后緣不投X線影像； d：鐵軌征A:Supine position; B:Lateral position; a:Texture thickening; b:Solid; c:Trailing edge does not cast X-ray image; d:Rail sign

2.2.4 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌采取的心臟、肺臟、脾臟、肝臟等組織分別接種于血瓊脂平板，在35 ℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，每個平板均可見相似且優(yōu)勢菌落，菌落為圓形，邊緣整齊、凸起、濕潤，顏色呈白色和淺黃色，直徑1～3 mm，周邊有明顯β溶血環(huán)。挑取單個菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，視野中可見革蘭陽性球菌，排列呈不規(guī)則葡萄狀，無芽孢，無莢膜。BP培養(yǎng)基定向培養(yǎng)，形成圓形、凸起、光滑的黑色菌落，外層有一淺透明環(huán)，符合金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)特征。

2.2.5 細(xì)菌16S rRNA鑒定 挑取菌落樣本，采用細(xì)菌16S rRNA序列全長通用引物(5′-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′)進(jìn)行擴增、測序、BLAST分析，結(jié)果在1 400 bp處擴增出明顯條帶(圖2)，菌株16S rRNA基因序列與金黃色葡萄球菌的同源性達(dá)100%。

圖2 小熊貓臟器分離細(xì)菌的PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of bacteria isolated from Ailurus fulgens organsM：DL5 000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：菌落樣本M：DL5 000 marker; 1:Colony samples

3 病理剖檢

3.1 組織器官病理剖檢 患病小熊貓于發(fā)病第7天死亡，死亡后第一時間進(jìn)行尸體剖檢，剖檢結(jié)果顯示，病變主要集中在肺臟、脾臟和腎臟。小熊貓胸腔有大量混有淡黃色纖維素凝塊的滲出液；肺組織腫脹明顯，呈暗紅色，肺前葉質(zhì)地堅實如肝，右肺前葉尖端腫大并有灰白色壞死灶,肺中葉和后葉表面有灰白色纖維絮狀滲出物，有半凝固的膿汁突出(中插彩版圖3A)，切開有半凝固膿汁流出(中插彩版圖3B)，病變組織切塊投入水中，完全下沉；腎臟腫脹，質(zhì)地變硬，呈灰黃色，切面紋理模糊不清(中插彩版圖3C)；心肌灰白色，質(zhì)地松軟，心包外有大量纖維絮狀滲出物(中插彩版圖3D)；脾臟腫脹呈暗紅色，廣泛性出血淤血，表面有粟粒大小、灰白色壞死灶(中插彩版圖3E)。

圖3 小熊貓器官病理剖檢觀察Fig.3 Observation on pathology of Ailurus fulgens organsA：肺臟； B：肺臟切面； C：腎臟切面； D：心臟； E：脾臟A:Lung; B:Lung section; C:Renal section; D:Heart； E:Spleen

3.2 組織病理學(xué)檢查 組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，肺間質(zhì)增寬，肺泡變薄(中插彩版圖4a)，有廣泛出血點和大量炎性細(xì)胞浸潤(中插彩版圖4b)，部分肺泡結(jié)構(gòu)喪失，肺泡內(nèi)存在大塊彌漫性壞死灶(中插彩版圖4c)；腎臟間質(zhì)增寬，存在散在出血點(中插彩版圖4d)，腎小球腫脹出血(中插彩版圖4e)，腎小管細(xì)胞脫落壞死，炎性細(xì)胞浸潤(中插彩版圖4f)；脾臟有大量出血和壞死灶(中插彩版圖4h)；心肌間隔增寬，肌纖維損傷斷裂，存在輕微出血和少量炎性細(xì)胞浸潤(中插彩版圖4i)。

圖4 小熊貓器官病理組織切片鏡檢觀察 (40×)Fig.4 Microscopic observation on pathological sections of Ailurus fulgens organs (40×)A和B：肺臟； C和D：腎臟； E：脾臟； F：心臟； a:間隙增寬； b：出血和炎性細(xì)胞浸潤； c：壞死灶； d：出血和間隙增寬；e：腎小球腫脹出血； f：腎小管脫落壞死； g：炎性細(xì)胞浸潤； h：出血和壞死； i：心肌出血和損傷A and B:Lung; C and D:Kidney; E:Spleen; F:Heart; a:Space widening; b:Hemorrhage and inflammatory cell infiltration; c:Necrotic foci; d:Hemorrhage and space widening; e:Glomerular swelling and bleeding; f:Renal tubular exfoliation and necrosis; g:Inflammatory cell infiltration; h:Hemorrhage and necrosis; i:Myocardial hemorrhage and injury

4 討論

大葉性肺炎的病程包括：充血水腫期、紅色肝變期、灰色肝變期、消散期，上述各期發(fā)展是連續(xù)的，彼此之間并無絕對界限，由于肺的各部先后受累，在同一肺葉或不同肺葉的病變并非處于同一時期，一些部位處于紅色肝變期，而另一些部位處于灰色肝變期[5]。本病例中，小熊貓肺臟上可見到不同時期的炎癥變化，肺葉切面色彩不一，呈大理石樣外觀，局部組織已經(jīng)形成膿腫，實變幾乎不可逆，進(jìn)而出現(xiàn)缺氧、嚴(yán)重呼吸困難。

金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性球菌，也是人獸共患病的重要致病菌，它在外界環(huán)境中隨處可見，在空氣、土壤和水等環(huán)境中均能存活，可在人和動物的皮膚及內(nèi)臟等處寄居[6]。在感染性疾病中，病原微生物混合感染現(xiàn)象比較常見，臨床癥狀多相似故不宜作為有效診斷依據(jù)，還需要開展微生物學(xué)鑒定[7]。本病例首先排除常見病毒病(犬瘟熱、犬細(xì)小病毒)，并開展細(xì)菌學(xué)病原篩查，在死亡小熊貓組織器官中分離出優(yōu)勢菌落，普通培養(yǎng)、BP培養(yǎng)基定向培養(yǎng)及16S rRNA測序結(jié)果均顯示致病菌為金黃色葡萄球菌。

金黃色葡萄球菌在特定條件下能夠引發(fā)疾病，通常產(chǎn)生皮膚軟組織感染、肺炎、腸炎、敗血癥和各種臟器的嚴(yán)重感染等[8]。金黃色葡萄球菌引起的肺炎常起病急驟，病情進(jìn)展快，易發(fā)生并發(fā)癥如肺大泡、肺膿腫、膿氣胸等，病死率高[9]。本病例中小熊貓的肺部病變最為明顯，其他臟器也均有不同程度病變，累及消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等，由于炎癥蔓延、呼吸衰竭、心力衰竭及敗血癥死亡。

3～4月份正值小熊貓發(fā)情季節(jié)，病例中小熊貓發(fā)病時處于3月份，發(fā)病前幾天氣溫驟降，天氣變化結(jié)合發(fā)情應(yīng)激可能會引起免疫力低下，或許是小熊貓感染大葉性肺炎病因之一。此外，動物園來往游客較多，若有攜帶致病菌的游客吐痰，散播在空氣中也可能致使小熊貓患病。治療過程中，第2～3天抗生素聯(lián)合使用，并且對癥進(jìn)行輸液，起到一定效果，小熊貓精神狀態(tài)有所恢復(fù)，運動能力增強，第4天時自行將留置針拔出，由于反抗能力增加，無有效保定措施，無法輸液，至第7天死亡。由此可見，有效的保定措施在野生動物疾病治療方面起關(guān)鍵作用，比如使用合適的保定籠，采取合理的化學(xué)保定方法。另外，在日常飼養(yǎng)管理方面，天氣突然變化，或受到驚嚇、應(yīng)激以及在小熊貓發(fā)情季節(jié)，應(yīng)適當(dāng)在飼料中增加營養(yǎng)添加劑，館舍內(nèi)加強消毒滅菌，都可以在一定程度上預(yù)防疾病的發(fā)生。