劉東旭 ， 沙萬(wàn)里 , 尹柏雙 , 李國(guó)江

(1. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林 吉林 132101；2. 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 吉林 吉林 132101)

養(yǎng)豬業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)重要的支柱之一，為提高生產(chǎn)效率，在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中，普遍采用早期斷奶技術(shù)，然而由于免疫發(fā)育不全以及斷奶造成的各種應(yīng)激，導(dǎo)致仔豬腹瀉成為現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的重要問(wèn)題之一[1]。

抗菌肽是由12～100個(gè)氨基酸殘基組成的一類蛋白質(zhì)或多肽，通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞膜或其他靶點(diǎn)作用殺滅細(xì)菌[2]。本試驗(yàn)以乳酸菌作為表達(dá)載體，重組豬β-防御素及PR-39抗菌肽(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide，PR-39)，觀察其對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和微生態(tài)體系的影響，從而為研制防治仔豬腹瀉的綠色無(wú)抗飼料添加劑提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 細(xì)菌選擇培養(yǎng)基、生化鑒定瓶，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；PCR酶、TaqMan酶、DNA marker、pGEM-T SimpleVector，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 重組乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank上公布的β-防御素及PR-39抗菌肽序列設(shè)計(jì)特異性引物，由長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司合成USP45信號(hào)肽序列。通過(guò)重疊延伸PCR法將β-防御素、PR-39抗菌肽及其融合產(chǎn)物與USP45信號(hào)肽進(jìn)行連接。采用NcoⅠ+XbaⅠ雙酶切乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148，根據(jù)同源臂重組技術(shù)分別將β-USP45、PR-39-USP45及融合基因β-PR-39-USP45與線性化的pNZ8148載體連接，電轉(zhuǎn)入乳酸菌宿主NZ9000中并進(jìn)行鑒定。

1.3 重組乳酸菌的表達(dá)及鑒定 將重組乳酸菌置于含有氯霉素及乳酸鏈球菌素(Nisin)的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別收集培養(yǎng)液和菌體進(jìn)行濃縮，應(yīng)用SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白。

1.4 重組乳酸菌的體外抑菌試驗(yàn) 將100 mL重組乳酸菌誘導(dǎo)表達(dá)24 h后，破碎菌體并進(jìn)行100倍濃縮。在1 mL三種重組乳酸菌和空載體濃縮液中，加入9 mL液體LB培養(yǎng)基，并分別加入10 μL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌(OD600=0.1)，37 ℃培養(yǎng)并繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.5 三種重組乳酸菌對(duì)斷奶仔豬腹瀉的影響

1.5.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組 將健康的21日齡三元雜交斷奶仔豬隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭仔豬?？瞻讓?duì)照組為MRS培養(yǎng)基組(A)，空載體pNZ8148組(B)，重組乳酸菌pNZ8148-β組(C)，重組乳酸菌pNZ8148-PR-39組(D)， 重組乳酸菌pNZ8148-β-PR-39組(E)。每組在每天的8時(shí)和16時(shí) 給料前胃內(nèi)灌注50 mL，試驗(yàn)期為28 d。

1.5.2 生長(zhǎng)指標(biāo)及腹瀉率的測(cè)定 每日8時(shí)稱量空腹仔豬重，計(jì)算平均日增重。觀察仔豬糞便形態(tài)、顏色及腹瀉情況,計(jì)算腹瀉率及腹瀉指數(shù)[3]。

1.5.3 細(xì)菌分離鑒定 試驗(yàn)第28天無(wú)菌手術(shù)收集各組仔豬腸道內(nèi)容物1 g，并溶于1 mL PBS中，進(jìn)行10倍倍比稀釋，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)及鑒定。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示。采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 重組乳酸菌的構(gòu)建及鑒定 通過(guò)PCR擴(kuò)增，分別得到273、399 bp和260 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小相符，成功構(gòu)建重組乳酸菌，分別命名為pNZ8148-β、pNZ8148-PR-39和pNZ8148-β-PR-39。

圖1 重組乳酸菌PCR鑒定結(jié)果Fig.1 The PCR results of recombinant lactic acid bacteriaM： 50 bp ladder相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1： pNZ8148-PR-39 PCR鑒定結(jié)果； 2： pNZ8148-β-PR-39 PCR鑒定結(jié)果； 3： pNZ8148-β PCR鑒定結(jié)果M: 50 bp ladder DNA marker; 1: PCR result of pNZ8148-PR-39; 2: PCR result of pNZ8148-β-PR-39; 3: PCR result of pNZ8148-β

2.2 重組乳酸菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 重組乳酸菌上清液和菌體中，外源基因表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，與空載體pNZ8148相比，pNZ8148-β在10.0 kDa處、pNZ8148-PR-39在9.5 kDa處、pNZ8148-β-PR-39在14.5 kDa處，誘導(dǎo)的上清液和菌體中均有外源蛋白的表達(dá)。

圖2 重組乳酸菌SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 The SDS-PAGE results of recombinant lactic acid bacteriaM： 14.3～97.2 kDa蛋白 marker； 1： pNZ8148-β上清液SDS-PAGE電泳結(jié)果； 2： pNZ8148-β菌體SDS-PAGE電泳結(jié)果； 3： pNZ8148-PR-39上清液SDS-PAGE電泳結(jié)果； 4： pNZ8148-PR-39菌體SDS-PAGE電泳結(jié)果； 5： pNZ8148-β-PR-39上清液SDS-PAGE電泳結(jié)果； 6： pNZ8148-β-PR-39菌體SDS-PAGE電泳結(jié)果； 7、8、9： pNZ8148空載體SDS-PAGE電泳結(jié)果M: Protein marker(14.3- 97.2 kDa); 1: SDS-PAGE results ofpNZ8148-β supernatant; 2: SDS-PAGE results of pNZ8148-βthallus; 3: SDS-PAGE results of pNZ8148-PR-39 supernatant; 4: SDS-PAGE results of pNZ8148-PR-39 thallus; 5: SDS-PAGE results of pNZ8148-β-PR-39 supernatant； 6： SDS-PAGEresults of pNZ8148-β-PR-39 thallus; 7,8,9: SDS-PAGE results of pNZ8148 blank vector

2.3 重組乳酸菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果 動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)曲線測(cè)定重組乳酸菌抑菌活性結(jié)果如中插彩版圖3所示，3種重組乳酸菌對(duì)大腸桿菌、沙門菌的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，pNZ8148-β和pNZ8148-β-PR-39對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用稍弱，而重組乳酸菌pNZ8148-PR-39對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)明顯抑制作用。

圖3 重組乳酸菌的體外抑菌試驗(yàn)Fig.3 In vitro antibacterial test of recombinant lactic acid bacteriaA: 大腸桿菌； B: 沙門菌； C: 金黃色葡萄球菌A: Escherichia coli； B: Salmonella； C: Staphylococcus aureus

2.4 重組乳酸菌對(duì)仔豬腸道菌群的影響 各組腸道內(nèi)容物細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果如圖4所示，仔豬基礎(chǔ)日糧中添加重組乳酸菌可降低腸道中大腸桿菌數(shù)量(P<0.05)。pNZ8148-β和pNZ8148-β-PR-39重組乳酸菌組對(duì)金黃色葡萄球菌及腸球菌抑制作用明顯(P<0.05)。

圖4 重組乳酸菌對(duì)仔豬腸道主要菌群的影響Fig.4 The effect of recombinant lactic acid bacteria on the main intestinal flora of piglets注：不同小寫字母表示組間差異顯著，P<0.05Note: Different lowercase letters mean significant difference among groups,P<0.05

2.5 重組乳酸菌對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響 斷奶仔豬的生產(chǎn)性能指標(biāo)監(jiān)測(cè)結(jié)果如表1所示，仔豬的初始體重沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，試驗(yàn)結(jié)束后，重組乳酸菌組的平均日增重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且呈現(xiàn)pNZ8148-β-PR-39>pNZ8148-β> pNZ8148-PR-39趨勢(shì)。對(duì)照組、pNZ8148-β、pNZ8148-PR-39、pNZ8148-β-PR-39的料肉比分別為1.47、1.39、1.41和1.37。對(duì)比對(duì)照組，其料肉比分別降低了5.44%、4.08%和6.80%，差異顯著(P<0.05)。

表1 重組乳酸菌對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響Table 1 Effect of recombinant lactic acid bacteria on growth performance of piglets

2.6 重組乳酸菌對(duì)仔豬腹瀉率及腹瀉指數(shù)的影響 各組斷奶仔豬腹瀉率與腹瀉指數(shù)所得結(jié)果如表2所示，仔豬基礎(chǔ)日糧中添加重組乳酸菌后，腹瀉率與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)。對(duì)比各組腹瀉指數(shù)及腹瀉率，pNZ8148-β-PR-39組對(duì)比對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，腹瀉率降低39.62%，腹瀉指數(shù)降低33.07%。

表2 重組乳酸菌對(duì)斷奶仔豬腹瀉率及腹瀉指數(shù)的影響Table 2 Effect of recombinant lactic acid bacteria on diarrhea rate and diarrhea index of weaned piglets

3 討論

內(nèi)源抗菌肽作為飼料添加劑，在維持腸道菌群平衡和抵御外源病原菌侵害方面比外源抗菌肽更具優(yōu)勢(shì)[4]。因?yàn)槟c道菌群平衡主要依靠?jī)?nèi)源益生菌和抗菌肽的調(diào)節(jié)作用。在動(dòng)物進(jìn)化的漫長(zhǎng)進(jìn)程中，動(dòng)物腸道中內(nèi)源的益生菌和抗菌肽建立了相互適應(yīng)機(jī)制，腸道益生菌可以和抗菌肽共存[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，3種重組蛋白的濃縮液對(duì)大腸桿菌、沙門菌均有一定的抑制效果，但PR-39抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有檢測(cè)到顯著的抗菌活性，而β-防御素則對(duì)大腸桿菌、沙門菌及金黃色葡萄球菌均有很好的抑制效果。PR-39含有豐富的脯氨酸，能抗多種革蘭陰性菌，如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、肺炎克雷伯桿菌等[[6]。Agerberth等對(duì)PR-39的抑菌分析研究結(jié)果顯示，其能夠抑制大腸桿菌、醋酸鈣不動(dòng)菌和鼠傷寒沙門菌[7]。β-防御素富含半胱氨酸和精氨酸，它是動(dòng)物黏膜組織，特別是胃腸道和呼吸道等抵御病原微生物的一道天然屏障[8]。β-防御素對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌都具有殺傷作用。綜合以上研究成果可以看出，本試驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者研究一致。

本試驗(yàn)以表達(dá)豬β-防御素和PR-39抗菌肽的乳酸菌飼喂仔豬，簡(jiǎn)化傳統(tǒng)的基因工程表達(dá)產(chǎn)物純化操作，發(fā)揮了乳酸桿菌和抗菌肽的益生功效，明顯改善了仔豬生長(zhǎng)性能，為新型綠色飼料添加劑的研制和應(yīng)用提供了依據(jù)。