梅 晨 ， 金 華 ， 辛 良 ， 張 雪 ， 胡 偉 ， 先 宏 ， 王宏俊

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京 海淀 100097 ； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院 ， 北京 海淀 100193 ； 3. 中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心病理科 ， 北京 海淀 100700)

犬是人類最早訓(xùn)化的動物，也是人類長期的好朋友，不僅分享共同的環(huán)境、生活習(xí)性和飲食活動[1]，甚至從遺傳學(xué)上看，腫瘤發(fā)生機制都十分相近[2]。犬的癌癥疾病一般都有很短的潛伏期，且伴侶犬的生活區(qū)域十分有限，一旦發(fā)現(xiàn)異常情況，動物主人能夠快速作出反應(yīng)。犬乳腺腫瘤的發(fā)生多是激素依賴型腫瘤，與人乳腺癌十分相似。因此，相同的生活環(huán)境、相似的生物學(xué)、組織病理學(xué)特征以及很多共同的危險因素，都使得犬乳腺腫瘤病例成為研究人類乳腺腫瘤疾病最好的動物模型[3]。在正常犬乳腺中，不同細胞的免疫表型不同，在犬乳腺癌的發(fā)展過程中通常保留了細胞特異性分化標(biāo)志物[4-5]，利用此特點可以用免疫組化染色方法，通過特異性抗體來識別腫瘤細胞的組織來源，以達到提高診斷準(zhǔn)確性的目的。同時免疫組化靈敏度高，可以識別腫瘤組織中的微轉(zhuǎn)移病灶，可為腫瘤的預(yù)后判斷提供依據(jù)。對一系列的腫瘤細胞進行增殖活性的測定，可用來評估其良惡性的關(guān)系。本試驗從動物醫(yī)院收集1例犬乳腺腫物，擬通過乳腺腫瘤組織病理切片H.E.染色、免疫組化及腫瘤細胞培養(yǎng)、免疫熒光等方法進行腫物病理診斷，為下一步探究致病機理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腫瘤組織及染色材料 乳腺腫瘤組織來自5歲 半雌性泰迪犬，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院提供。所需試劑：10%的福爾馬林、石蠟、甲醛、飽和碳酸鋰、伊紅、蘇木素、蒸餾水、70%酒精、75%酒精、80%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠。過碘酸(HIO4·2H2O)、醋酸鈉、堿性品紅、鹽酸、偏重硫酸鈉、Schiff氏液、純酒精、蒸餾水。萊卡切片機、恒溫箱、干燥箱、濕盒、萊卡光學(xué)顯微鏡。鼠單克隆抗體ER(Invitrogen，MA1-12692)、兔多克隆抗體PR(Invitrogen，PA5-82322)、鼠單克隆抗體HER-2(Invitrogen，MA5-13105)、兔單克隆抗體P63(Invitrogen，MA3-026)、鼠單克隆抗體SMA(Invitrogen，14-9760-82)、鼠單克隆抗體CK5/6(Invitrogen，53-9003-82)、鼠單克隆抗體Ki-67(Invitrogen,14-5698-82)、鼠單克隆抗體SOX-2(Invitrogen,MA1014)、FITC熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG(Abcam，ab6785)等，均購自北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。

1.2 腫瘤組織進行病理切片觀察 將手術(shù)摘除的腫瘤組織切割成5 mm×3 mm×3 mm組織塊，立即投入10%中性福爾馬林固定，酒精梯度脫水，浸蠟包埋后備用。切片機設(shè) 3 μm的石蠟切片，進行常規(guī)蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,H.E.)染色和免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)染色[6-7]，顯微鏡下觀察并分析染色結(jié)果，進行病理組織學(xué)診斷。

1.3 腫瘤組織免疫組化試驗 選擇腫瘤組織豐富區(qū)域的切片樣本，免疫組化測定雌激素受體(Estrogen,ER)、孕激素受體(Progesterone,PR)、人表皮生長因子受體-2(Human epidermal growth factor-2,HER-2)、P63、細胞角蛋白 5/6(Cytokeratin 5/6，CK5/6)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等細胞特征性標(biāo)志物的表達情況。操作步驟參照文獻[7]，首先對組織切片進行脫蠟處理，并放置于3%過氧化氫條件下進行室溫孵育10 min， 待內(nèi)源性過氧化物酶徹底滅活后，加入正常山羊血清于室溫下封閉20 min。隨后分別加入上述標(biāo)志物的單克隆抗體4 ℃過夜，抗鼠酶標(biāo)二抗37 ℃ 孵育20 min，然后行二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明，封固后以光鏡進行觀察。

1.4 犬乳腺癌細胞原代培養(yǎng) 將外科手術(shù)無菌摘除的乳腺腫瘤樣本迅速送往細胞培養(yǎng)實驗室，在無菌超凈工作臺內(nèi)，將組織放置于一次性培養(yǎng)皿內(nèi)，使用DMEM培養(yǎng)液清洗3次，使用消毒后的鑷子和剪刀，將腫瘤組織切割成10 mm3左右的組織塊，在培養(yǎng)皿內(nèi)加入含100萬單位/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，振蕩1 min，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中。離心后的沉淀再次加入DMEM培養(yǎng)基及Ⅱ型 膠原酶(Sigma,V900892)，振蕩30 min，轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，1 000 r/min離心5 min，離心后的沉淀再次加入DMEM培養(yǎng)基，重懸、再離心。重復(fù)3次。 之后，1000 r/min離心5 min，棄上清。在離心管中加入DMEM培養(yǎng)基，將沉淀重懸后轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃ 5%CO2條件下進行培養(yǎng)，3～4 d后加入10%的胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 犬乳腺癌細胞純化 細胞層長至70%～80%后，用0.25%胰蛋白酶將細胞完全消化下來，用含10%血清的DMEM/F12終止消化，1 000 r/min離心10 min后棄上淸，用完全培養(yǎng)基重懸細胞并重新接種于細胞培養(yǎng)瓶中，于1 h內(nèi)將培養(yǎng)基吸出，加入到新的細胞瓶中重新培養(yǎng)。利用成纖維細胞貼壁速度明顯快于上皮細胞的特點，可將上皮細胞純化出來。將用差速貼壁法初步純化的細胞正常消化后制備成單細胞懸液。在細胞計數(shù)板計算出細胞的濃度。用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至每100 μL 含有10個細胞，充分混勻后，均勻加入96孔板中，100 μL/孔。 每隔3 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基，如此培養(yǎng)10～14 d可見到一些孔中會長出細胞群落，即為純化的犬乳腺癌細胞。經(jīng)5～7 代的連續(xù)純化，細胞狀態(tài)穩(wěn)定時進行凍存和后續(xù)試驗。

1.6 犬乳腺癌細胞生長曲線檢測 參考文獻[8]所用方法，將生長至第30代的細胞調(diào)整至細胞濃度為105個/mL，接種到25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，1 mL/瓶。 用DMEM/F12完全培養(yǎng)基補足終體積為5 mL/瓶，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)9 d。每隔24 h 取3個重復(fù)的細胞瓶，胰酶消化后用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，繪制細胞生長曲線，并計算細胞倍增時間。

1.7 犬乳腺癌細胞免疫熒光檢測 將培養(yǎng)好的細胞分為2個組，每組為 3個細胞爬片，棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗1遍，4%多聚甲醛室溫固定10 min，分別用PBS洗3遍，1%Triton X-100 透膜 10 min，PBS 洗3遍， 用山羊血清封閉40 min。一組滴加單克隆抗體SOX-2(1∶100稀釋)，另一組滴加Ki-67單抗(1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS 洗 3 遍，兩組分別滴加FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG (1∶100稀釋)，室溫避光孵育1 h，PBS 洗 3 遍，DAPI染色10 min，PBS 洗 3 遍，封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查與處理 經(jīng)手術(shù)鈍性剝離瘤樣物，豌豆大小硬結(jié)共3個，全部摘除。摘除的瘤樣物外周沒有包膜，堅硬，灰白色，切角有淺粉色大理石花紋。

2.2 H.E.染色組織學(xué)觀察 常規(guī)H.E.染色觀察，如中插彩版圖1所示，中插彩版圖1A及圖1C中乳腺瘤樣物中乳腺正常結(jié)構(gòu)完全被破壞。中插彩版圖1B中腫瘤細胞向管腔內(nèi)突起生長，越往管腔中心，腫瘤細胞越大，胞質(zhì)越豐富，核越大，核分裂相多見，有的腫瘤細胞發(fā)生顆粒變性和空泡變性。

圖1 犬腫瘤組織切片的H.E.染色Fig.1 H.E. staining of canine tumor tissue sectionsA： 犬乳腺癌； B： 犬乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌； C： 犬乳腺癌A: Canine breast cancer; B: Canine intraductaL carcinoma; C: Canine breast cancer

2.3 免疫組化染色組織學(xué)觀察 本病例的免疫組化結(jié)果如中插彩版圖2所示，ER、PR、HER-2表達均為陰性；切片中一部分細胞P63呈陽性表達，且在細胞胞質(zhì)中呈高表達，為棕色或深棕色。CK5/6在組織切片中廣泛表達于細胞外周，α-SMA 顯示有部分肌成纖維細胞呈深褐色，提示該癌癥屬于原位癌或者浸潤程度不高的早期浸潤癌。綜上所述，此腫瘤為三陰性乳腺癌，并且預(yù)后不良。

圖2 犬腫瘤組織切片的免疫組化染色Fig.2 Immunohistochemical staining of canine tumor tissue sectionsA： 腫瘤蛋白P63； B： 細胞角蛋白5/6； C：α-平滑肌肌動蛋白； D：孕激素受體； E：雌激素受體； F：人表皮生長因子受體-2A:P63; B:CK5/6; C:α-SMA; D:PR; E:ER; F:HER-2

2.4 犬乳腺癌細胞純化及細胞生長曲線檢測 如圖3所示，細胞經(jīng)純化后形態(tài)單一，呈條索狀。生長曲線如圖4所示，制作好標(biāo)準(zhǔn)曲線后，對細胞連續(xù)培養(yǎng)9 d，檢測細胞在450 nm的吸光值，并計算出活細胞數(shù)量。經(jīng)計算，細胞倍增時間為26.35 h。

圖3 純化后犬乳腺癌細胞 (200×)Fig.3 Canine mammary tumor cells after purification(200×)

圖4 細胞生長曲線Fig.4 Cell growth curve

2.5 犬乳腺癌細胞免疫熒光檢測 抗原Ki-67是一種核蛋白，它與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)，Ki-67抗原的失活導(dǎo)致核糖體RNA合成受到抑制。Ki-67可以作為一個細胞增殖的標(biāo)記物[8]。在病理報告中的Ki-67表達指數(shù)高低與許多腫瘤分化程度、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。陽性率越高，腫瘤增殖越快，惡性程度越高。SOX-2是維持干細胞多向分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，有維持細胞自我更新和增殖的能力，在胚胎發(fā)育及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要作用。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，SOX-2的異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生、分化程度、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后等方面關(guān)系密切[9]。本病例腫瘤細胞的細胞核及細胞質(zhì)中均高表達Ki-67及SOX-2，核質(zhì)染色清晰，立體感強，無特異性背景。結(jié)果如中插彩版圖5、圖6所示。提示純化后的細胞為犬乳腺癌細胞。

圖5 犬乳腺癌細胞表達Ki-67Fig.5 Expression of Ki-67 in canine mammary tumor cellsA：合并圖層； B：細胞核DAPI顯色； C：FITC熒光A:Merge; B:DAPI of nuclei; C:FITC fluorescence

圖6 犬乳腺癌細胞表達SOX-2Fig.6 Expression of SOX-2 in canine mammary tumor cellsA：合并圖層； B：細胞核DAPI顯色； C：FITC熒光A:Merge; B:DAPI of nuclei; C:FITC fluorescence

3 討論

自發(fā)性犬乳腺腫瘤是未絕育雌性犬常見的腫瘤，又是人類乳腺癌極佳代替模型[10]。作為犬最常見的腫瘤性疾病，其發(fā)病率達母犬腫瘤性疾病的50%[11]。在犬乳腺腫瘤中大約有50%為惡性腫瘤，即乳腺癌。通常易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此多預(yù)后不良，對犬尤其是雌性犬的生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅。常規(guī)的組織學(xué)診斷方法有一定的局限性，尤其是在精準(zhǔn)識別腫瘤細胞成分方面存在誤判的可能，組織學(xué)診斷為實體癌的犬乳腺腫瘤，經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)其不止1種腫瘤細胞成分的病例多有發(fā)生[12]。因此，確切地鑒別出癌細胞特征性標(biāo)志物有助于準(zhǔn)確診斷，也有助于腫瘤的預(yù)后判斷。

由于腫瘤的發(fā)生是多基因參與的過程，還涉及遺傳與環(huán)境的相互作用，用單個癌基因標(biāo)記物進行診斷是不現(xiàn)實的，將幾個指標(biāo)聯(lián)合檢測可提高診斷的準(zhǔn)確性。隨著生物信息及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，大大推動了腫瘤標(biāo)記物測定技術(shù)的發(fā)展，蛋白組學(xué)在多種腫瘤檢測方面均有較好的靈敏性。細胞癌變之后，可出現(xiàn)正常細胞不具備的抗原、蛋白、酶和糖蛋白等物質(zhì)，這些物質(zhì)稱為腫瘤標(biāo)記物。在本病例中，在腫瘤組織切片H.E.染色判定為乳腺癌的基礎(chǔ)上，通過使用不同腫瘤標(biāo)記物ER、PR、HER-2、CK5/6、α-SMA及P63等來檢測其在腫瘤組織中的表達情況并對結(jié)果進行分析，確診該病例為浸潤程度較低的三陰性犬乳腺癌。ER、PR、HER-2、P63、CK5/6、α-SMA等均是經(jīng)驗證的犬乳腺癌組織的主要生物學(xué)標(biāo)志物[13]。采用免疫組織化學(xué)法檢測患犬腫瘤組織中這些標(biāo)志物等的表達情況，有助于確定腫瘤的性質(zhì)判定。雌激素和孕激素在乳腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，而它們發(fā)揮作用的基礎(chǔ)是與細胞表面的一種特殊的結(jié)構(gòu)—激素受體相結(jié)合。檢測乳腺癌細胞的ER和PR，可以幫助判定該腫瘤是否對內(nèi)分泌治療敏感。HER-2是表皮生長因子受體家族的一員，此家族在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，是細胞生長、分化及存活的重要調(diào)節(jié)者。該基因的擴增目前已成為臨床醫(yī)學(xué)上評估乳腺癌惡性程度、乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后風(fēng)險的重要指標(biāo)。CK5/6 主要表達在皮膚的基底細胞、棘層細胞和部分前列腺基底細胞，于其他單層腺上皮不表達。CK5/6已被證實為三陰性(ER、PR、HER-2均為陰性)乳腺癌的特征性分子標(biāo)記物。有研究表明，CK5/6的表達可以作為乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物[14]，陽性為乳腺癌預(yù)后差的標(biāo)志[15]。P63是乳腺肌上皮細胞非常敏感而特異的標(biāo)志物。在乳腺良性病變中，腺泡和導(dǎo)管周圍可見連續(xù)的P63+肌上皮細胞圍繞，在乳腺癌早期浸潤灶及浸潤性癌中，P63染色顯示肌上皮細胞大部分消失或無肌上皮細胞。從乳腺良性病變到原位癌、早期浸潤癌和浸潤癌，肌上皮的消失是一個逐漸發(fā)展的過程，50%以上腫瘤的發(fā)生發(fā)展都伴有P63的突變或異常表達。因此，P63有助于乳腺良、惡性病變的診斷和鑒別診斷。Ki-67是一種在靜止期細胞中不表達的非組蛋白，只能在細胞增殖期被檢測到，反映細胞的增殖活性。在細胞層面，細胞免疫熒光結(jié)果表明，細胞Ki-67及SOX-2高表達，確定該細胞為癌細胞[16-17]。

過去幾十年間，很多研究聚焦于人或動物腫瘤標(biāo)志物，但是至今仍沒有非常完善的檢測體系。目前被研究關(guān)注最多的乳腺腫瘤標(biāo)志物仍為Ki-67、HER-2、ER、PR、SOX-2等[18]。完美的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)滿足在血液中就可輕松檢測并只在惡性腫瘤中高表達的特性；還應(yīng)滿足在特定腫瘤中特異性表達，且能夠明確提示預(yù)后。血清中的腫瘤標(biāo)志物比組織腫瘤標(biāo)志物有以下優(yōu)勢：測量過程是非侵入性的；在臨床癥狀出現(xiàn)前能夠顯示生理及病理的動態(tài)變化[16,19]。到目前為止，在血清及組織檢測中最具有說服力的是miRNAs，因為其具有高特異性及靈敏度。然而，目前多數(shù)研究只局限于少量樣本評估檢測，在未來的研究中需要有更多細節(jié)的標(biāo)化[20-21]。

此外，目前犬腫瘤診斷大多借鑒人類腫瘤的判定標(biāo)準(zhǔn)，并且免疫組化試驗完全依據(jù)人類腫瘤蛋白標(biāo)記物的反應(yīng)性。由于存在種屬差異性，許多人類腫瘤標(biāo)記蛋白在犬臨床診斷時沒有經(jīng)過充分驗證，部分標(biāo)志物的抗體在犬類病例中沒有陽性反應(yīng)。因此，很有必要系統(tǒng)地完善犬屬動物的腫瘤診斷方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。