曹利利，宮鵬濤，姜 旭,，郭衍冰，宋建臣，董 航，姚新華，苑淑賢,王 治

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 130062；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延邊 133000；4.北部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 250014）

禽白血?。╝vian leukosis）是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽α反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的，以造血細(xì)胞增生為主的一類(lèi)腫瘤性疾病[1]。ALV作為我國(guó)二類(lèi)動(dòng)物疫病，能夠誘發(fā)禽類(lèi)的多種腫瘤性疾病，致使生產(chǎn)性能下降，甚至死亡。自1908年首次分離該病毒以來(lái)，ALV呈全球流行，嚴(yán)重制約了世界各國(guó)的禽業(yè)發(fā)展[2]。ALV作為國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012～2020年）中優(yōu)先防治的病原[3]，目前只能依靠病原檢測(cè)為手段淘汰陽(yáng)性雞，進(jìn)而達(dá)到凈化的目的[4]。因此，精準(zhǔn)診斷對(duì)于有效防控ALV至關(guān)重要[5]。

ALV基因組中主要包括gag、pol、env基因，在不同亞群間，gag編碼的p27蛋白十分保守且同源性達(dá)96%以上[6]，含有許多可以用于檢測(cè)的抗原表位[7]。以往研究常借助原核系統(tǒng)表達(dá)p27蛋白用于ALV檢測(cè)方法的建立。研究表明，酵母方法和大腸桿菌表達(dá)相比，有細(xì)胞繁殖快，培養(yǎng)與試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)[8]，且因畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的高效性，研究者們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)多種外源蛋白的高效表達(dá)[9-10]。而目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)畢赤酵母表達(dá)ALV p27蛋白的相關(guān)報(bào)道。利用畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的高穩(wěn)定、高表達(dá)、高分泌、高密度生長(zhǎng)的特性，本研究對(duì)禽白血病的種間特異性抗原p27蛋白進(jìn)行表達(dá)，獲得的表達(dá)產(chǎn)物為制備包被抗原，建立禽白血病病毒ELISA檢測(cè)方法或組裝試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞DF1、細(xì)胞禽白血病標(biāo)準(zhǔn)毒株HRPS-103[11]由本實(shí)驗(yàn)室保存；巴斯德畢赤酵母GS115購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 載體與工具酶表達(dá)載體pPIC9K購(gòu)自Invitrogen公司；pMD18-T載體、dNTP、Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ、NotⅠ、T4 DNA連接酶等均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑與試劑盒病毒基因組RNA提取試劑盒、DL2000 DNA marker、PCR反應(yīng)試劑、pre-stained protein marker購(gòu)自天根生化科技有限公司；通用型RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Biospin膠回收試劑盒購(gòu)自BioFlux公司；Plasmid Miniprep Purification Kit Ⅱ 購(gòu)自捷恩麥克生物科技有限公司；ALV檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司；Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.4 p27基因的克隆

1.4.1 引物合成 查找已發(fā)表的AIV全基因序列中p27的基因序列（GenBank登錄號(hào)：Z46390.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，且兩端分別含有EcoRⅠ與NotⅠ酶切位點(diǎn)。p27-F：GA CGAATTCATGAAGACAGAGGGACCCGCCTG，p27-R：AGGCGGCCGCTTAATGATGATGATGAT GATGCTACGCGGCTATGCCTTGATCCG。

1.4.2 cDNA合成 按照病毒RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取ALV HRPS-103的RNA，以禽白血病總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，于-20℃保存。

1.4.3 p27基因的擴(kuò)增 以ALV cDNA為模板擴(kuò)增p27基因。反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，引物p27-F/R各1 μL， ddH2O 10 μL，2×Taq PCR Master Mix 4 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行初步判斷。

1.4.4 pMD18-T-p27的構(gòu)建 對(duì)含有p27基因片段進(jìn)行膠回收，與pMD18-T載體相連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將pPIC9K載體與構(gòu)建的質(zhì)粒pMD18-T-p27分別進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，在4℃條件下通過(guò)T4 DNA Ligase連接酶連接過(guò)夜。取酵母感受態(tài)細(xì)胞80 μL同10 μL構(gòu)建的質(zhì)粒pPIC9K-p27輕混后進(jìn)行電轉(zhuǎn)，隨后取電轉(zhuǎn)產(chǎn)物100 μL均勻涂布于含有Zeocin的YPDS培養(yǎng)基中，在30℃條件下培養(yǎng)3～5 d后，挑取單菌落接種于5 mL液體YPDS培養(yǎng)基中，在28～30℃、250 rpm條件下振蕩過(guò)夜，隨后提取菌液基因組以PCR進(jìn)行鑒定。

1.6 p27蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將重組菌培養(yǎng)至OD600值為2～6時(shí)，于1000 ×g條件下離心5 min后收集菌體，以BMMY重懸至OD600值為1.0，持續(xù)培養(yǎng)120 h，期間每隔24 h取樣1 mL并加入甲醇用于誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，取出的菌液以4000×g離心8 min，收集上清液。

定義10 稱(chēng)fti+v/ti+v-1′(A′(ti+v)/A′(ti+v-1))為變換φi下，馬爾可夫過(guò)程{ξ(t)，t∈T}，(t1 <…

1.7 SDS-PAGE鑒定將處理后的樣品加入SDSPAGE凝膠孔中，濃縮膠部分以80 V條件電泳，分離膠部分以120 V條件電泳。電泳結(jié)束后將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)R-250中緩緩搖動(dòng)染色4 h，而后在脫色液中脫色至凝膠條帶清晰。

1.8 Western blot鑒定切割SDS-PAGE電泳后凝膠至適當(dāng)大小，同時(shí)裁剪一張略大于膠的PVDF膜并以甲醇激活，濾紙?zhí)崆霸谵D(zhuǎn)膜液中浸泡，按照陰極、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙、陽(yáng)極的順序放置，排除中間氣泡后，110 V條件下濕轉(zhuǎn)30 min；取出膜在封閉液中封閉2 h后，加入ALV陽(yáng)性血清作為一抗，4℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次5 min，加入1∶5000稀釋的HRP兔抗雞IgY作為二抗，于37℃搖動(dòng)孵育1 h后TBST洗膜3次，每次5 min；在膜上滴適量DAB顯色后拍照保存。

1.9 p27蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化以單菌落接種YPD液體培養(yǎng)基，30℃條件下220 rpm振蕩培養(yǎng)24 h。取100 μL重組菌液接入50 mL BMGY中，每隔5 h取樣一次測(cè)定OD600值，記錄并繪制生長(zhǎng)曲線。各條件的優(yōu)化方法如下：

（1）目的蛋白表達(dá)量檢測(cè)：取5 mL菌液，離心收集上清液，按照Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。經(jīng)DHS NanoPro 2010/2020超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定蛋白表達(dá)量。（2）誘導(dǎo)時(shí)間：重組菌共誘導(dǎo)表達(dá)120 h，每隔24 h取樣1次，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。（3）甲醇誘導(dǎo)濃度：每隔24 h向培養(yǎng)基中添加1次甲醇，使甲醇終濃度分別為1.5%、1.25%、1%、0.75%、0.5%、0.25%，在培養(yǎng)72 h后檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。（4）pH值：以PBS緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0，在其他誘導(dǎo)條件相同的情況下檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。（5）誘導(dǎo)溫度：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溫度分別為30℃、28℃、26℃、24℃，在其他誘導(dǎo)條件相同的情況下檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，如圖1所示，在760 bp處有條帶顯示，且大小與預(yù)期一致。

圖1 p27基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of p27 gene

2.2 pMD18-T-p27的酶切鑒定將pMD18-T與目的基因p27連接成功后提取質(zhì)粒，以限制性?xún)?nèi)切酶（EcoRⅠ和NotⅠ）進(jìn)行雙酶切，如圖2所示，在760 bp處有條帶顯示且與預(yù)期大小一致。

圖2 pMD-p27的雙酶切產(chǎn)物Fig.2 pMD-p27 double digestion results

2.3 測(cè)序結(jié)果分析將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中目的片段大小為717 bp，與已公布的AIV基因序列（GenBank登錄號(hào)：Z46390.1）相比同源性為100%。

2.4 酵母表達(dá)株的鑒定將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPIC9K-p27雙酶切后進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖3所示，在760 bp處有條帶顯示，與預(yù)期大小一致。說(shuō)明成功構(gòu)建pPIC9K-p27。

圖3 重組酵母株pPIC9K-p27的鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of the recombinant yeast strain pPIC9K-p27

圖4 PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR identification results

2.6 p27蛋白的鑒定

2.6.1 SDS-PAGE結(jié)果 SDS-PAGE凝膠結(jié)果如圖5所示，約30 kDa處有條帶顯示，且與p27蛋白預(yù)期大小相符，并將表達(dá)的重組蛋白命名為rp27。

圖5 重組蛋白rp27的SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE results of rp27 protein

2.6.2 Western blot結(jié)果 Western blot顯色結(jié)果如圖6所示，約30 kDa處有條帶顯示，與預(yù)期相符，說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白p27具有良好的反應(yīng)原性。

圖6 重組蛋白rp27的Western blot結(jié)果Fig.6 Western blot results of rp27 protein

2.7 表達(dá)條件的優(yōu)化

2.7.1 重組菌生長(zhǎng)曲線 持續(xù)觀察酵母的培養(yǎng)及生長(zhǎng)情況，如圖7所示，10 h后酵母菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)至30 h期間OD600呈逐漸上升趨勢(shì)，隨后重組菌生長(zhǎng)速度減緩。

圖7 重組菌體的生長(zhǎng)曲線Fig.7 Growth curve of recombinant bacteria

2.7.2 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果 如圖8A所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的逐步延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)呈快速上升趨勢(shì)，直至72 h時(shí)表達(dá)量最大，隨后繼續(xù)誘導(dǎo)重組蛋白rp27產(chǎn)量則略有下降。

2.7.3 甲醇濃度的優(yōu)化結(jié)果 如圖8B所示，當(dāng)甲醇濃度為1.0%時(shí)p27蛋白表達(dá)量最大，而濃度或高或低時(shí)重組蛋白rp27產(chǎn)量都會(huì)減少。

2.7.4 pH值的優(yōu)化結(jié)果 如圖8C所示，以不同pH條件培養(yǎng)重組菌，rp27蛋白的表達(dá)量有所不同，當(dāng)培養(yǎng)液pH值為7.0時(shí)rp27表達(dá)量最大。

2.7.5 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化結(jié)果 如圖8D所示，重組菌在不同溫度誘導(dǎo)條件下，當(dāng)溫度為28℃時(shí)rp27蛋白的表達(dá)量最高。

圖8 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化Fig.8 Optimization of induction conditions

3 討論

檢測(cè)p27已成為國(guó)內(nèi)外種群凈化ALV的常用方法之一，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)構(gòu)建目的重組質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)以酵母分泌表達(dá)，首次在國(guó)內(nèi)通過(guò)畢赤酵母系統(tǒng)制備了高純度的p27蛋白。對(duì)于ALV的診斷國(guó)外已有商品化試劑盒，國(guó)內(nèi)也有利用大腸桿菌表達(dá)p27蛋白及建立檢測(cè)方法等研究，但仍存在價(jià)格昂貴，分離提取p27蛋白的產(chǎn)量少，成本較高，生物學(xué)活性較低等問(wèn)題。周晨妍等[12-14]分別將木聚糖酶 Xyn43A和 抗病毒蛋白R(shí)C28在大腸桿菌及畢赤酵母中的表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果表明畢赤酵母表達(dá)較優(yōu)，且相比于大腸桿菌系統(tǒng)可有效克服蛋白翻譯后加工以及修飾不夠的難題。毛婭卿等[12]通過(guò)原核誘導(dǎo)表達(dá)p27蛋白約為27 kDa，而本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的P27蛋白約為30 kDa，分析其原因，推測(cè)可能是與畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)過(guò)程中對(duì)蛋白進(jìn)行了翻譯修飾有關(guān)，這一推測(cè)與胡青松等[16]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。為了保證了重組蛋白與天然p27蛋白結(jié)構(gòu)和功能的相似，本研究選擇酵母分泌表達(dá)目的蛋白，為研究p27衣殼蛋白的生物學(xué)功能，以及與宿主相互作用等提供基礎(chǔ)。

以往研究表明，畢赤酵母表達(dá)體系相較于其他原核或真核表達(dá)系統(tǒng)，不僅能夠提高重組蛋白的生物學(xué)活性，還具有對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)勢(shì)[17]。但它也存在一定不足，如分泌表達(dá)的蛋白可被自身分泌的蛋白酶降解，有些蛋白表達(dá)量較低或者發(fā)生過(guò)度糖基化等，但可以通過(guò)其他技術(shù)手段盡量揚(yáng)長(zhǎng)避短。在畢赤酵母生長(zhǎng)與誘導(dǎo)過(guò)程中，時(shí)間、pH、溫度、甲醇濃度等都會(huì)影響到p27蛋白的表達(dá)[18]，選擇最適合的反應(yīng)條件能有效的提升蛋白的表達(dá)量[19-20]。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)不斷優(yōu)化各種反應(yīng)條件，確保能夠獲得高表達(dá)的p27蛋白，相比以往的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)體系生長(zhǎng)周期短且提純過(guò)程技術(shù)簡(jiǎn)單成熟，加之發(fā)酵生產(chǎn)中安全性較高，更適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，為下一步診斷試劑盒的商品化生產(chǎn)與應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。