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含纈酪肽蛋白促進IBV的胞內運輸

2021-08-31 01:21:24曉,王歡,丁鏟,廖
中國動物傳染病學報 2021年4期
關鍵詞:孵育基因組標志物

袁 曉,王 歡,丁 鏟,廖 瑛

(中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

VCP(Valosin-containing protein),即含纈酪肽蛋白,是三磷酸腺苷酶超家族中的一員,在不同物種中具有高度的同源性[1-2]。VCP參與蛋白降解、膜融合、DNA修復與復制、調控細胞周期,激活NF-κB信號通路等生理活動,并具有抗細胞凋亡、啟動轉錄因子及參與細胞內吞等作用[3]。已有文獻報道,VCP與內吞小體復合物相結合,在膜融合和囊泡轉運過程中發(fā)揮著重要作用[4]。干擾VCP的表達導致內吞小體體積增大,不能成熟[5]。

禽傳染性支氣管炎(avian infectious bronchitis,IB)是雞群的急性、高度接觸性的傳染性疾病,由禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染引起,屬于禽類的四大病毒性疾病之一,給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經濟損失[6-7]。研究發(fā)現(xiàn),IBV發(fā)生感染和進入宿主細胞時,依賴網(wǎng)格蛋白內吞方式進入細胞,依次通過早期內體、晚期內體、溶酶體,在酸性環(huán)境中發(fā)生膜融合,釋放病毒基因組進入細胞質[8]。因此,內體的成熟在IBV的感染中起到重要的作用。已有研究表明:干擾VCP的表達,導致入胞的IBV滯留在早期內體,不利于IBV的復制和增殖[4]。本研究通過干擾或外源表達VCP,檢測IBV的基因組復制水平和蛋白表達水平,并檢測VCP的亞細胞位置,進一步證實VCP在IBV感染和增殖中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞和試劑IBV(Beaudette株)由華南農業(yè)大學劉定祥實驗室贈予;Vero細胞和HeLa細胞由本實驗室保存;siRNA購自吉瑪生物公司;VCP抗體和β-actin抗體購自CST公司;IBV-N蛋白抗體由劉定祥實驗室贈予;Rab5、Rab7、LAMP1抗體購自CST公司;FuGENE轉染試劑購自Promega公司;Lipofectamine 2000購自賽默飛公司;GFP-VCP質粒由本實驗室構建。

1.2 siRNA干擾和病毒感染將Vero細胞計數(shù),并按照5×105/孔的細胞數(shù)接種至6孔板。siRNA的轉染按照Lipofectamine 2000說明書進行操作。48 h后,接種IBV(MOI=1),感染后12 h收取樣品,通過Western blot檢測病毒蛋白的表達水平,熒光定量RT-PCR檢測病毒RNA的復制水平。siVCP-F:5'-AAGUAGGGUAUGAUGACAUUG-3',siVCP-R:5'-CAAUGUCAU- CAUACCCUACUU-3'。

1.3 GFP-VCP的構建對VCP(GenBank登錄號:AB232593.1)全基因進行克隆。PCR產物經測序正確后,將其連接至真核表達載體pEGFP-N1中,獲得重組表達質粒pEGFP-N1-VCP。VCP-F:5'-CC CAAGCTTGCCACCATGATTCGGCTCTTCTCGGCT-3';VCP-R:5'-CGGGGTACCCGAGCGGTGGCAAGCG AC-3'。

1.4 質粒轉染和病毒感染將Vero細胞計數(shù),并按照5×105/孔的細胞數(shù)接種至6孔板。GFP-VCP質粒的轉染按照FuGENE的說明書進行操作。轉染后36 h接種病毒(MOI=1),感染后12 h收取樣品,通過Western blot檢測病毒蛋白的表達水平,熒光定量RT-PCR檢測病毒RNA的復制水平。

1.5 SDS-PAGE和Western blot將蛋白樣品12 000 ×g離心10 min,取10 μL上樣,80 V恒壓電泳30 min后,120 V恒壓電泳100 min。將蛋白膠與海綿、濾紙、PVDF膜按照“膠正膜負”的方式排成轉印用的“三明治結構”,250 mA恒流轉印90 min。5%脫脂乳室溫封閉PVDF膜2 h,依次孵育一抗和二抗各1 h,分別用TBST清洗3遍。將PVDF膜在ECL發(fā)光顯色液中孵育20 s,在全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能公司)上檢測蛋白表達信號。

1.6 RNA抽提和熒光定量RT-PCR往6孔板的每孔中加入1 mL TRIzol試劑,室溫靜置5 min,待細胞完全裂解后,將裂解液轉移至無RNA酶EP管中;向EP管中加入200 μL氯仿,震蕩15 s,室溫靜置5~10 min;4℃、12 000 ×g離心15 min,將上層水相轉移到新的無RNA酶EP管中,再加入等量異丙醇,-20℃沉淀RNA 1 h或者更長時間;4℃、12 000 ×g離心20 min,棄去上清液;加入1 mL的75%乙醇,4℃、12 000 ×g離心10 min,棄去上清液;在超凈臺中,風干RNA沉淀物,加入30 μL的DEPC水,使其充分溶解,然后用微量核酸蛋白測定儀NanoDrop 2000c分光光度計測定RNA濃度。

根據(jù)測定的RNA濃度,取2 μg RNA,用DEPC水補足至33.5 μL,加入2 μL引物18T,或病毒基因特異性引物R-gRNA(+),或病毒基因特異性引物R-gRNA(-),70℃水浴10 min,再迅速轉移至冰上3~5 min。按照表1所示的50 μL反轉錄體系加緩沖液、dNTP、RNA酶抑制劑和反轉錄酶置于42℃反轉錄2 h。將RNA反轉為cDNA后,置于75℃滅活5 min,儲存于-20℃,備用。反轉錄體系為:2 μg DEPC水和RNA,2 μL的18T隨機引物特異性引物R-gRNA(+)或R-gRNA(-),10 μL的5×反轉錄緩沖液,2 μL的dNTP,1 μL的RNA酶抑制劑。以cDNA為模板,采用SYBR Green染料法進行PCR測定。按熒光定量RT-PCR反應體系,在實時定量PCR儀器設置如下反應程序:94℃預變性3 min,94℃變性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸20 s,共40個循環(huán)。通過溶解曲線分析,采用2-ΔΔCT法計算目的基因RNA相對表達量,內參基因采用β-actin,引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.7 間接免疫熒光實驗以pEGFP-N1-VCP質粒轉染Vero細胞24 h,以1 MOI IBV感染細胞。分別在感染后0 h、1 h、2 h,每孔加入1 mL新鮮配制的5%多聚甲醛,室溫固定10 min,預冷的TBST清洗3遍;每孔加入1 mL含有5%BSA的TBST溶液,37℃封閉30 min,TBST清洗3遍;分別孵育Rab5、Rab7和LAMP1抗體1 h,TBST清洗3遍,然后避光孵育帶有熒光二抗1 h,TBST清洗3遍,孵育DAPI稀釋液5 min左右,TBST清洗3遍。取出蓋玻片倒扣在滴有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上,避光風干過夜后放4℃保存,通過蔡司激光共聚焦顯微鏡避光觀察和成像。

2 結果

2.1 干擾VCP的表達不利于病毒的增殖轉染siRNA干擾VCP的表達,36 h后接種IBV。感染12 h后收取細胞樣品,通過Western blot檢測VCP的干擾效果和IBV N蛋白的表達。與sic對照組相比較,siVCP成功地干擾了VCP的表達;病毒蛋白IBV-N的表達水平在干擾VCP的細胞中略有減少(圖1A),揭示干擾VCP的表達,不利于IBV的增殖。進一步檢測IBV RNA水平,發(fā)現(xiàn)病毒的正鏈RNA和負鏈RNA在干擾VCP的細胞中均有下降(圖B)。以上結果證實VCP能夠促進病毒的復制。

圖1 干擾VCP對IBV增殖的影響Fig.1 siVCP affect the IBV replication

2.2 外源表達VCP促進IBV增殖以GFP-VCP轉染Vero細胞,24 h后以1 MOI IBV感染細胞,12 h后收取樣品,檢測病毒N蛋白的表達水平和基因組RNA復制水平。與表達GFP的對照組相比較,外源表達GFP-VCP明顯促進IBV-N蛋白的表達和病毒基因組RNA復制(圖2A、2B),證實VCP有助于病毒的復制和增殖。在感染后2 h檢測進入細胞的病毒基因組,則發(fā)現(xiàn)病毒的內吞不受VCP表達水平的影響,說明VCP在病毒內吞后促進病毒的感染(圖2C)。

圖2 過表達GFP-VCP對IBV感染的影響Fig.2 Overexpression of the GFP-VCP affect the IBV infection

2.3 GFP-VCP與內體標志物Rab5發(fā)生共定位IBV發(fā)生網(wǎng)格蛋白依賴型內吞后,通過細胞的內體系統(tǒng)進行運輸,依次通過早期內體、晚期內體,到達溶酶體[8]。已有報道表明,敲除VCP后導致IBV病毒粒子滯留在早期內體[4]。為了探究VCP在病毒的胞內運輸中發(fā)揮作用,我們檢測了GFP-VCP在病毒入胞過程中的亞細胞定位。以GFP-VCP轉染Vero細胞,24 h后以1 MOI的IBV感染細胞,分別在0 h、1 h和2 h收取細胞進行間接免疫熒光實驗,檢測GFP-VCP跟早期內體標志物Rab5、晚期內體標志物Rab7、溶酶體標志物LAMP1的共定位。結果可知,在感染后0、1、2 h,VCP均與早期內體標志物Rab5共定位,不跟晚期內體標志物Rab7或溶酶體標志物LAMP1共定位(圖3)。以上結果說明:在病毒感染過程中,VCP定位于早期內體,可能參與早期內體的成熟,因而促進IBV從早期內體運輸?shù)酵砥趦润w。

圖3 GFP-VCP過表達時,與早期內體的定位關系Fig.3 Location between the early endosome and GFP-VCP

3 討論

VCP能夠形成同源六聚體,參與內質網(wǎng)相關的蛋白降解、線粒體相關的蛋白降解和細胞自噬[9],阻止錯誤折疊蛋白的累積;在細胞壓力解除時,VCP參與應激顆粒小體的解聚和恢復mRNA翻譯;在胞內運輸系統(tǒng)參與膜融合,促進早期內體的成熟,參與胞內運輸。由此可見,VCP是個多功能蛋白。本研究發(fā)現(xiàn):干擾VCP的表達,明顯抑制IBV的復制和增殖;過表達VCP蛋白,則促進IBV的增殖,但對IBV的內吞沒有明顯影響。因此,初步判斷VCP在病毒被細胞內吞后發(fā)揮作用。進一步實驗發(fā)現(xiàn):VCP蛋白在IBV感染過程中定位于早期內體,揭示VCP有可能參與早期內體的成熟,對于依賴早期內體運輸?shù)腎BV起著促進胞內運輸作用,進一步證實了之前的研究結果[4]。VCP是否對依賴于早期內體運輸?shù)牟《揪写龠M作用,還有待于進一步證實。

除了通過促進胞內運輸系統(tǒng)的成熟,VCP還有可能通過其他方式促進病毒增殖。例如,VCP促進應激顆粒小體的解聚,能夠恢復病毒mRNA的翻譯[10];VCP通過促進RIG-I的降解,負向調控干擾素的表達[11]。前人研究表明,VCP在多種病毒的感染中發(fā)揮重要作用:例如,在辛德比斯病毒感染中,VCP能夠調控其受體NRAMP2的胞內運輸,促進病毒的入胞[12];在西尼羅河病毒感染過程中,VCP參與病毒生命周期的早期感染步驟和基因組復制過程[13];在脊髓灰質炎病毒的感染過程中,VCP有可能參與病毒的釋放途徑。因此,VCP可能在不同病毒的生活周期發(fā)揮作用,影響病毒的增殖。

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