袁 曉，王 歡，丁 鏟，廖 瑛

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

VCP（Valosin-containing protein），即含纈酪肽蛋白，是三磷酸腺苷酶超家族中的一員，在不同物種中具有高度的同源性[1-2]。VCP參與蛋白降解、膜融合、DNA修復與復制、調控細胞周期，激活NF-κB信號通路等生理活動，并具有抗細胞凋亡、啟動轉錄因子及參與細胞內吞等作用[3]。已有文獻報道，VCP與內吞小體復合物相結合，在膜融合和囊泡轉運過程中發(fā)揮著重要作用[4]。干擾VCP的表達導致內吞小體體積增大，不能成熟[5]。

禽傳染性支氣管炎（avian infectious bronchitis，IB）是雞群的急性、高度接觸性的傳染性疾病，由禽傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）感染引起，屬于禽類的四大病毒性疾病之一，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經濟損失[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，IBV發(fā)生感染和進入宿主細胞時，依賴網(wǎng)格蛋白內吞方式進入細胞，依次通過早期內體、晚期內體、溶酶體，在酸性環(huán)境中發(fā)生膜融合，釋放病毒基因組進入細胞質[8]。因此，內體的成熟在IBV的感染中起到重要的作用。已有研究表明：干擾VCP的表達，導致入胞的IBV滯留在早期內體，不利于IBV的復制和增殖[4]。本研究通過干擾或外源表達VCP，檢測IBV的基因組復制水平和蛋白表達水平，并檢測VCP的亞細胞位置，進一步證實VCP在IBV感染和增殖中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞和試劑IBV（Beaudette株）由華南農業(yè)大學劉定祥實驗室贈予；Vero細胞和HeLa細胞由本實驗室保存；siRNA購自吉瑪生物公司；VCP抗體和β-actin抗體購自CST公司；IBV-N蛋白抗體由劉定祥實驗室贈予；Rab5、Rab7、LAMP1抗體購自CST公司；FuGENE轉染試劑購自Promega公司；Lipofectamine 2000購自賽默飛公司；GFP-VCP質粒由本實驗室構建。

1.2 siRNA干擾和病毒感染將Vero細胞計數(shù)，并按照5×105/孔的細胞數(shù)接種至6孔板。siRNA的轉染按照Lipofectamine 2000說明書進行操作。48 h后，接種IBV（MOI=1），感染后12 h收取樣品，通過Western blot檢測病毒蛋白的表達水平，熒光定量RT-PCR檢測病毒RNA的復制水平。siVCP-F：5'-AAGUAGGGUAUGAUGACAUUG-3'，siVCP-R：5'-CAAUGUCAU- CAUACCCUACUU-3'。

1.3 GFP-VCP的構建對VCP（GenBank登錄號：AB232593.1）全基因進行克隆。PCR產物經測序正確后，將其連接至真核表達載體pEGFP-N1中，獲得重組表達質粒pEGFP-N1-VCP。VCP-F：5'-CC CAAGCTTGCCACCATGATTCGGCTCTTCTCGGCT-3'；VCP-R：5'-CGGGGTACCCGAGCGGTGGCAAGCG AC-3'。

1.4 質粒轉染和病毒感染將Vero細胞計數(shù)，并按照5×105/孔的細胞數(shù)接種至6孔板。GFP-VCP質粒的轉染按照FuGENE的說明書進行操作。轉染后36 h接種病毒（MOI=1），感染后12 h收取樣品，通過Western blot檢測病毒蛋白的表達水平，熒光定量RT-PCR檢測病毒RNA的復制水平。

1.5 SDS-PAGE和Western blot將蛋白樣品12 000 ×g離心10 min，取10 μL上樣，80 V恒壓電泳30 min后，120 V恒壓電泳100 min。將蛋白膠與海綿、濾紙、PVDF膜按照“膠正膜負”的方式排成轉印用的“三明治結構”，250 mA恒流轉印90 min。5%脫脂乳室溫封閉PVDF膜2 h，依次孵育一抗和二抗各1 h，分別用TBST清洗3遍。將PVDF膜在ECL發(fā)光顯色液中孵育20 s，在全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）上檢測蛋白表達信號。

1.6 RNA抽提和熒光定量RT-PCR往6孔板的每孔中加入1 mL TRIzol試劑，室溫靜置5 min，待細胞完全裂解后，將裂解液轉移至無RNA酶EP管中；向EP管中加入200 μL氯仿，震蕩15 s，室溫靜置5～10 min；4℃、12 000 ×g離心15 min，將上層水相轉移到新的無RNA酶EP管中，再加入等量異丙醇，-20℃沉淀RNA 1 h或者更長時間；4℃、12 000 ×g離心20 min，棄去上清液；加入1 mL的75%乙醇，4℃、12 000 ×g離心10 min，棄去上清液；在超凈臺中，風干RNA沉淀物，加入30 μL的DEPC水，使其充分溶解，然后用微量核酸蛋白測定儀NanoDrop 2000c分光光度計測定RNA濃度。

根據(jù)測定的RNA濃度，取2 μg RNA，用DEPC水補足至33.5 μL，加入2 μL引物18T，或病毒基因特異性引物R-gRNA（+），或病毒基因特異性引物R-gRNA（-），70℃水浴10 min，再迅速轉移至冰上3～5 min。按照表1所示的50 μL反轉錄體系加緩沖液、dNTP、RNA酶抑制劑和反轉錄酶置于42℃反轉錄2 h。將RNA反轉為cDNA后，置于75℃滅活5 min，儲存于-20℃，備用。反轉錄體系為：2 μg DEPC水和RNA，2 μL的18T隨機引物特異性引物R-gRNA（+）或R-gRNA（-），10 μL的5×反轉錄緩沖液，2 μL的dNTP，1 μL的RNA酶抑制劑。以cDNA為模板，采用SYBR Green染料法進行PCR測定。按熒光定量RT-PCR反應體系，在實時定量PCR儀器設置如下反應程序：94℃預變性3 min，94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。通過溶解曲線分析，采用2-ΔΔCT法計算目的基因RNA相對表達量，內參基因采用β-actin，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.7 間接免疫熒光實驗以pEGFP-N1-VCP質粒轉染Vero細胞24 h，以1 MOI IBV感染細胞。分別在感染后0 h、1 h、2 h，每孔加入1 mL新鮮配制的5%多聚甲醛，室溫固定10 min，預冷的TBST清洗3遍；每孔加入1 mL含有5%BSA的TBST溶液，37℃封閉30 min，TBST清洗3遍；分別孵育Rab5、Rab7和LAMP1抗體1 h，TBST清洗3遍，然后避光孵育帶有熒光二抗1 h，TBST清洗3遍，孵育DAPI稀釋液5 min左右，TBST清洗3遍。取出蓋玻片倒扣在滴有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，避光風干過夜后放4℃保存，通過蔡司激光共聚焦顯微鏡避光觀察和成像。

2 結果

2.1 干擾VCP的表達不利于病毒的增殖轉染siRNA干擾VCP的表達，36 h后接種IBV。感染12 h后收取細胞樣品，通過Western blot檢測VCP的干擾效果和IBV N蛋白的表達。與sic對照組相比較，siVCP成功地干擾了VCP的表達；病毒蛋白IBV-N的表達水平在干擾VCP的細胞中略有減少（圖1A），揭示干擾VCP的表達，不利于IBV的增殖。進一步檢測IBV RNA水平，發(fā)現(xiàn)病毒的正鏈RNA和負鏈RNA在干擾VCP的細胞中均有下降（圖B）。以上結果證實VCP能夠促進病毒的復制。

圖1 干擾VCP對IBV增殖的影響Fig.1 siVCP affect the IBV replication

2.2 外源表達VCP促進IBV增殖以GFP-VCP轉染Vero細胞，24 h后以1 MOI IBV感染細胞，12 h后收取樣品，檢測病毒N蛋白的表達水平和基因組RNA復制水平。與表達GFP的對照組相比較，外源表達GFP-VCP明顯促進IBV-N蛋白的表達和病毒基因組RNA復制（圖2A、2B），證實VCP有助于病毒的復制和增殖。在感染后2 h檢測進入細胞的病毒基因組，則發(fā)現(xiàn)病毒的內吞不受VCP表達水平的影響，說明VCP在病毒內吞后促進病毒的感染（圖2C）。

圖2 過表達GFP-VCP對IBV感染的影響Fig.2 Overexpression of the GFP-VCP affect the IBV infection

2.3 GFP-VCP與內體標志物Rab5發(fā)生共定位IBV發(fā)生網(wǎng)格蛋白依賴型內吞后，通過細胞的內體系統(tǒng)進行運輸，依次通過早期內體、晚期內體，到達溶酶體[8]。已有報道表明，敲除VCP后導致IBV病毒粒子滯留在早期內體[4]。為了探究VCP在病毒的胞內運輸中發(fā)揮作用，我們檢測了GFP-VCP在病毒入胞過程中的亞細胞定位。以GFP-VCP轉染Vero細胞，24 h后以1 MOI的IBV感染細胞，分別在0 h、1 h和2 h收取細胞進行間接免疫熒光實驗，檢測GFP-VCP跟早期內體標志物Rab5、晚期內體標志物Rab7、溶酶體標志物LAMP1的共定位。結果可知，在感染后0、1、2 h，VCP均與早期內體標志物Rab5共定位，不跟晚期內體標志物Rab7或溶酶體標志物LAMP1共定位（圖3）。以上結果說明：在病毒感染過程中，VCP定位于早期內體，可能參與早期內體的成熟，因而促進IBV從早期內體運輸?shù)酵砥趦润w。

圖3 GFP-VCP過表達時，與早期內體的定位關系Fig.3 Location between the early endosome and GFP-VCP

3 討論

VCP能夠形成同源六聚體，參與內質網(wǎng)相關的蛋白降解、線粒體相關的蛋白降解和細胞自噬[9]，阻止錯誤折疊蛋白的累積；在細胞壓力解除時，VCP參與應激顆粒小體的解聚和恢復mRNA翻譯；在胞內運輸系統(tǒng)參與膜融合，促進早期內體的成熟，參與胞內運輸。由此可見，VCP是個多功能蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)：干擾VCP的表達，明顯抑制IBV的復制和增殖；過表達VCP蛋白，則促進IBV的增殖，但對IBV的內吞沒有明顯影響。因此，初步判斷VCP在病毒被細胞內吞后發(fā)揮作用。進一步實驗發(fā)現(xiàn)：VCP蛋白在IBV感染過程中定位于早期內體，揭示VCP有可能參與早期內體的成熟，對于依賴早期內體運輸?shù)腎BV起著促進胞內運輸作用，進一步證實了之前的研究結果[4]。VCP是否對依賴于早期內體運輸?shù)牟《揪写龠M作用，還有待于進一步證實。

除了通過促進胞內運輸系統(tǒng)的成熟，VCP還有可能通過其他方式促進病毒增殖。例如，VCP促進應激顆粒小體的解聚，能夠恢復病毒mRNA的翻譯[10]；VCP通過促進RIG-I的降解，負向調控干擾素的表達[11]。前人研究表明，VCP在多種病毒的感染中發(fā)揮重要作用：例如，在辛德比斯病毒感染中，VCP能夠調控其受體NRAMP2的胞內運輸，促進病毒的入胞[12]；在西尼羅河病毒感染過程中，VCP參與病毒生命周期的早期感染步驟和基因組復制過程[13]；在脊髓灰質炎病毒的感染過程中，VCP有可能參與病毒的釋放途徑。因此，VCP可能在不同病毒的生活周期發(fā)揮作用，影響病毒的增殖。