戚賀亭，潘兆平，李想，劉倩，王琛，于洋，廖艷芳，付復(fù)華*

1(湖南大學(xué) 研究生院隆平分院，湖南 長沙，410125)2(湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙，410125)3(果蔬貯藏加工及質(zhì)量安全湖南省重點實驗室，湖南 長沙，410125)4(湖南省果蔬加工與質(zhì)量安全國際科技創(chuàng)新合作基地，湖南 長沙，410125)

柑橘果茶是一種將柑橘果肉掏空，晾干之后填入茶葉，后經(jīng)風(fēng)干收縮而成的復(fù)合果茶，如柑普茶、柑白茶和檸檬紅茶等。近年來，由于其潛在的健康效應(yīng)和獨特的口感，越來越受到消費者的青睞。湘柑茶是利用湖南豐富的柑橘和茶葉資源，采用湖南主要栽培的特色柑橘品種的柑皮與安化天尖茶為原料，經(jīng)過挖果、填茶、殺青、干燥等工藝加工而成的一種“湘式”新茶飲。柑橘果茶的柑殼和陳皮原料近似，陳皮根據(jù)果實成熟度的不同又可以分為青皮、微紅皮和大紅皮。ZHANG等[1]利用代謝組學(xué)對廣陳皮不同成熟期化學(xué)特性進行分析，發(fā)現(xiàn)它們的黃酮類物質(zhì)、檸檬苦素、生物堿和酚酸的含量不同。青皮在預(yù)防心腦血管疾病、抗癌抗腫瘤方面效果更佳，而大紅皮具有更加明顯的抑菌、消炎、止咳等生理活性[2]。香氣成分是評價茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，新會柑普茶的不同成熟度的茶枝柑制得的柑普茶的風(fēng)味物質(zhì)存在顯著差異[3]。綜上所述，不同的成熟度的柑果對柑橘茶的品質(zhì)有很大的影響。

頂空氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)(headspace-gas chromatography-ion mobility spectrometry, HS-GC-IMS)是一種基于氣相色譜和離子遷移譜技術(shù)的新技術(shù)，其可以檢測未經(jīng)預(yù)處理的液體或固體樣品中揮發(fā)性有機物的指紋圖譜，從而更完整地保存樣品的風(fēng)味。由于儀器對具有高負(fù)電性或強質(zhì)子親和性官能團結(jié)構(gòu)的識別具有較高的靈敏度，因此利用氣相色譜和離子遷移譜技術(shù)的新技術(shù)分析食品風(fēng)味物質(zhì)具有獨特的優(yōu)勢。此外，由系統(tǒng)生成的指紋可以更直觀、方便地觀察樣品間的差異。近年來，HS-GC-IMS被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域的揮發(fā)性化合物分析，如中藥[4]、蜂蜜[5]、覆盆子酒[6]等。然而，GC-IMS儀器無法準(zhǔn)確測定揮發(fā)成分含量。因此，將IMS與其他設(shè)備相結(jié)合能夠增強其優(yōu)勢，以便對香氣進行全面評價。氣味活性值(odor activity value，OAV)計算被廣泛應(yīng)用于食品中關(guān)鍵氣味活性化合物的篩選和鑒定[7]。常用的揮發(fā)性有機物測定方法是頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜(head space-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)技術(shù)，它可以根據(jù)保留指數(shù)進行比較鑒定，通過加入內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)進行準(zhǔn)確的定量分析。據(jù)此，可以進一步進行OAV計算，篩選出關(guān)鍵香氣化合物。到目前為止，還沒有涉及柑橘果茶中的香氣成分OAV值的報道。

本實驗首次以金盆柚和天尖茶為原料制備湘柑茶，研究不同成熟度的金盆柚制備的果茶的加工品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)、感官評價等，同時通過HS-GC-IMS技術(shù)結(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析湘柑茶香氣品質(zhì)，并采用主成分分析對湘柑茶品質(zhì)進行綜合評價，以期為消費者對不同成熟度的柑橘制備的湘柑茶的選擇比較和產(chǎn)品推廣等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸、蘆丁、柚皮苷(均為標(biāo)準(zhǔn)品)，成都曼思特生物科技有限公司；橙皮苷(標(biāo)準(zhǔn)品)，美國MCE公司；氫氧化鈉、環(huán)己酮、碳酸鈉、亞硝酸鋁、亞硝酸鈉(均為分析純)，甲醇(色譜純)，國藥集團化學(xué)試劑公司。

金盆柚，湖南省岳陽縣惠泰云有限公司；天尖茶，湖南省白沙溪茶廠有限責(zé)任公司。采用未成熟、半成熟、完全成熟的金盆柚果實與天尖茶葉進行制備湘柑茶。樣品名稱和具體原料信息見表1。

表1 湘柑茶信息表Table 1 Information sheet on Xianggan teas ingredients

1.2 儀器與設(shè)備

DE-500 g型多功能粉碎機，浙江紅景天工貿(mào)有限公司；DHG-9053A型鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；E1204-IC型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；Acquity超高效液相色譜儀，美國Waters公司；Color Quest XE型全自動色度分析儀，美國Hunter Lab公司；Flavour Spec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀：內(nèi)置500 V/cm電場強度、300 MBq輻射氚、5 kV 漂移電壓、98 mm遷移管的IMS標(biāo)準(zhǔn)模塊，F(xiàn)S-SE-54-CB-1氣相色譜多毛細(xì)管柱(15 m×0.53 mm×0.2 μm)，德國G.A.S公司；6890 N-5973型氣相色譜質(zhì)譜儀(NIST08譜庫)，美國Agilent公司；二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷萃取頭(DVB/PDMS，50/30 μm，65 μm)，德國默克公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 湘柑茶待測樣品的制備

湘柑茶制備：將采摘的金盆柚新鮮柑果用清水洗凈后從頂部開蓋，挖出果肉并再次清洗晾干，填充市售的天尖茶至柑果殼3/4高度，蓋上頂蓋，85 ℃殺青2 h后轉(zhuǎn)45 ℃烘干。每隔30 min對湘柑茶進行稱重，直到湘柑茶質(zhì)量不變?yōu)橹埂?/p>

待測樣制備：將每種湘柑茶成品分成A、B、C 3組：A組取湘柑茶的柑皮液氮輔助下進行研磨，粉碎機粉碎，過40目篩并混合均勻，錫箔袋封口后放在15 ℃下貯藏待進行柑皮相應(yīng)理化指標(biāo)的測定；B組取整個成品進行液氮研磨，粉碎機粉碎，過40目篩并混合均勻，錫箔袋封口后放在15 ℃下貯藏待進行香氣成分的測定；C組成品用來測定色度和進行感官評價。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 加工特性

湘柑茶的加工特性包括原料果皮厚度、挖果難易程度、成品湘柑茶形態(tài)，具體評價表如下。

表2 湘柑茶加工特性評價表Table 2 Evaluation table of processing characteristics of Xianggan teas

1.3.2.2 色度

用色度分析儀測定湘柑茶柑皮的色澤，記錄L*值、a*值和b*值取平均值。其中L*值為樣品的亮度值，a*值為紅綠值，b*值為黃藍(lán)值。

1.3.2.3 總黃酮含量

參考SN/T 4592─2016《出口食品中總黃酮的測定》中的分光光度法測定。取1.3.1中的A組1 g待測樣品加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇50 mL，40 ℃超聲提取50 min后，濾入100 mL容量瓶中。重復(fù)過濾2次，合并濾液待測。吸取2.0 mL樣品溶液，用氫氧化鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%)補充至5.0 mL，加1 mL硝酸鈉(50 g/L)，搖勻，放置6 min，加入1.5 mL硝酸鋁(100 g/L)，搖勻，放置6 min，加入4 mL 氫氧化鈉(200 g/L)，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。在510 nm波長處測定吸光度值。結(jié)果以每克樣品中蘆丁質(zhì)量表示。

1.3.2.4 總酚含量

采用福林-酚法[8]測定。取1.3.1中的A組1 g待測樣品加10 mL甲醇，50 ℃超聲處理30 min，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液于容量瓶中，殘渣以10 mL甲醇重復(fù)提取2次，合并上清液，用甲醇定容至50 mL，待測。吸取2 mL待測液于10 mL刻度比色管中，加5.0 mL蒸餾水，再加0.5 mL福林酚試劑，搖勻1 min后再加入1.5 mL碳酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)，將樣品放入45 ℃的水浴鍋反應(yīng)15 min，取出樣品后充分搖勻，在765 nm處測其吸光度值。

1.3.2.5 橙皮苷和柚皮苷含量

采用UPLC法[9]測定。樣品預(yù)處理：取1.3.2.3中制備的待測液，過0.22 μm濾膜后待測。

UPLC條件：Waters Acquity UPLC BEH Cis鍵合色譜柱(180 mm×2.1 mm×1.7 pirn)；流動相：甲醇(流動相A)，水(流動相B)；洗脫條件：采用梯度洗脫，0～3 min，40%～45%流動相A；3～7 min，45%～40%流動相A；7～50 min，40%流動相A。流速0.15 mL/min；進樣量2 μL；柱溫30 ℃；檢測波長283 nm；橙皮苷、柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y=23 689x-41 965,R2=0.996 7；y=23 681x-69 798,R2=0.997 6。

1.3.2.6 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測定

(1)HS-GC-IMS檢測條件

頂空孵化溫度80 ℃，孵化時間20 min，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。載氣為高純氮氣(≥99.999%)，色譜柱溫度60 ℃，色譜運行時間30 min，載氣的流速梯度設(shè)置為2 mL/min保持2 min，在20 min內(nèi)線性增至100 mL/min后保持10 min。頂空進樣針溫度85 ℃、進樣量100 μL。

(2)HS-GC-MS檢測條件

參照遵循呂海鵬等[10]的方法，稍作修改。如下：

頂空-固相微萃?。喝組6 g待測樣品移入20 mL 頂空進樣瓶中，加入4 mL飽和氯化鈉溶液和10 μL的內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮(50 mg/L，乙醇稀釋)后，立即用聚四氟乙烯隔墊密封，60 ℃水浴平衡5 min，頂空萃取30 min后，插入老化好的萃取頭，在250 ℃的氣相色譜進樣器中無分裂解吸5.5 min。

J&W DB-5石英毛細(xì)色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至125 ℃保持3 min，然后以2 ℃/min升至180 ℃保持3 min，最終在15 ℃/min時增至230 ℃保持6 min；載氣(He)流速1.0 mL/min，壓力2.4 kPa，進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度230 ℃；母離子m/z285；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z35～550。

通過質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)NIST 08文庫的保留指數(shù)比較，采用內(nèi)標(biāo)法計算揮發(fā)性化合物的含量。

1.3.2.7 感官評價

對制備的3種湘柑茶樣品進行10 s沸水洗茶后，以1∶50(g∶mL)用煮茶器煮茶20 min后進行感官評價。組成20人評定小組(男女各10人)，對湯色(20分)，香氣(30分)，滋味(30分)和形態(tài)(20分)進行評定，具體評價標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 湘柑茶感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation criteria of Xianggan teas

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

以T1、T2、T3 3種湘柑茶樣品的理化指標(biāo)和關(guān)鍵香氣成分作為樣本單元進行主成分分析；采用SPSS 20.0對湘柑茶的理化指標(biāo)進行ANOVA方差分析(P<0.05表示差異顯著)，采用Origin 2020作圖；OAV值的計算參考PANG等[11]的方法；所有實驗均重復(fù)4次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

HS-GC-IMS數(shù)據(jù)使用LAV(Laboratory Analytical Viewer)軟件進行，使用內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進行定性分析；Reporter插件直接對樣品進行二維圖譜差異性對比；Gallery Plot插件程序構(gòu)建揮發(fā)性指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘柑茶的加工特性

如圖1所示，湘柑茶的加工品質(zhì)中果皮的厚度是T2最適宜，太薄會在干燥過程中變脆，產(chǎn)生裂紋，太厚則不利于茶葉填充。隨著金盆柚成熟度的增加，囊衣與果皮結(jié)合越松散，越容易挖果。3種樣品的湘柑茶形態(tài)表面均光滑，形態(tài)良好。加工品質(zhì)總分最高的是T3，達(dá)74.8分。

圖1 加工特性雷達(dá)圖Fig.1 Processing characteristics radar chart

2.2 湘柑茶外型及色度

湘柑茶外型為圓型，外部是柑皮殼，內(nèi)里為茶葉，頂蓋開口。其色澤是最直觀的外部體現(xiàn)，在一定程度上影響消費者的選擇。柑橘在制備湘柑茶的過程中會發(fā)生柑皮顏色的變化，不同的成熟度的柑橘制備的湘柑茶具有顯著區(qū)別。不同成熟度柑橘制備的湘柑茶外型如圖2所示，各色澤值的比較見圖3。

湘柑茶的體積隨著柑橘的成熟度的增加逐漸增大，T1最小，T2適中，T3最大，這與柑橘新鮮果實的大小一致。L*是明度指數(shù)，表示色彩的明暗度，由圖3可知,T3的L*值高于其他樣品，T1次之。a*值為呈色物質(zhì)的紅綠值，正值時表示紅色程度，負(fù)值時表示綠色程度[9]。T1的a*值為負(fù)值，偏向綠色，與其他樣品差異顯著(P<0.05)；T2的a*值小于T3，且均為正值，即代表顏色偏向紅色。b*值為黃藍(lán)值，從黃(+b*)到藍(lán)(-b*)漸變，湘柑茶的b*均為正值，代表偏黃，且T3最偏黃。上述色度與圖2的T1感官顏色為綠色，T2為暗橘色，T3為橘黃色相符。

圖2 湘柑茶樣品Fig.2 Sample of Xianggan tea

圖3 不同湘柑茶的色度Fig.3 The color of different Xianggan tea

2.3 總黃酮和總酚的含量

總黃酮(total flavonoid, TF)和總酚(total phenols, TP)是自由基清除劑，可以預(yù)防心血管疾病，能夠抗炎癥、降低血脂、血糖等。由圖4可知，柑皮中TF含量隨著柑橘的成熟逐漸降低，其中T1中TF含量最高為9.2 mg/g，相比其他樣品較為顯著(P<0.05)。這與施學(xué)驕[12]發(fā)現(xiàn)隨著酸橙果實成熟度增加，總黃酮含量均呈現(xiàn)遞減的變化趨勢一致。湘柑茶中TP的含量均大于7 mg/g，且T2中TP含量最高，T3次之，T1最低。WANG等[13]研究表明，茶枝柑(Citrusreticulata‘Chachi’)果皮中綠原酸、對香豆酸和阿魏酸在果皮成熟過程中積累量分別增加了26.7%、17.2%和31.7%。這些酚類化合物的積累促進了TP含量的增加。以采收期為維度，同一柑橘品種中TP的含量隨生長期的延長呈先增加后減少[14]。這與湘柑茶的柑皮的采收時間不同而導(dǎo)致的TP變化一致。

圖4 總酚和總黃酮含量Fig.4 Total phenol and flavonoids content注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 橙皮苷和柚皮苷含量

柑桔皮中黃酮類物質(zhì)種類繁多, 但現(xiàn)今分離提取主要集中在其中的橙皮苷和柚皮苷上；同時, 這2種物質(zhì)是所有柑桔屬植物的果皮中含量最大的生物活性成分[15]。在本研究中，以金盆柚為原料的同一類型湘柑茶中柚皮苷的含量均大于橙皮苷。其中，由圖5可知，隨著金盆柚采摘的成熟度逐漸增加，湘柑茶中柚皮苷與橙皮苷的差值也越來越大，在T3中兩者差值達(dá)到最高為15.2 mg/g。這與施學(xué)驕[12]對5～7月采摘的枳殼的橙皮苷與柚皮苷的關(guān)系的分析相同。除此之外，湘柑茶中橙皮苷含量隨著原料成熟度增大呈下降趨勢，且含量均大于3.5 mg/g，滿足《中華人民共和國藥典》[16]規(guī)定陳皮的入藥級標(biāo)準(zhǔn)。然而，柚皮苷的含量則呈相反趨勢，T1中柚皮苷的含量(15.6 mg/g)遠(yuǎn)低于T2(19.4 mg/g)和T3(20.6 mg/g)。酸橙隨著果實成熟度的增加，柚皮苷的含量往往也相應(yīng)增加。研究表明，YOO等[17]和WANG等[13]分別發(fā)現(xiàn)日本柚子和茶枝柑果皮中的柚皮苷的含量隨著果實的成熟而升高，與本研究結(jié)果一致。

圖5 橙皮苷和柚皮苷含量Fig.5 Hesperidin and naringin content

2.5 不同成熟度柑橘對湘柑茶香氣的影響

2.5.1 HS-GC-IMS分析結(jié)果

2.5.1.1 湘柑茶中香氣化合物的鑒定

用C2～C9的正丁酮至正壬酮作為外標(biāo)參考計算每種化合物的保留指數(shù)，基于揮發(fā)性物質(zhì)的氣相色譜保留時間和離子漂移時間對揮發(fā)性組分進行定性分析。以現(xiàn)有的軟件內(nèi)置NIST氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與IMS漂移時間數(shù)據(jù)庫資料，共鑒定出85個峰，定性檢出64種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類12種、醛類18種、酯類9種、酮類10種、萜烯類10種、雜環(huán)類4種和硫化物2種(表4)。此外，還檢測到一些數(shù)據(jù)庫中未包含的物質(zhì)。一些單一化合物在漂移時間尺度上具有多重信號，這可以解釋為分析離子與中性分子(如二聚體和水合物)之間的加合物在IMS漂移管的運動過程中形成。研究表明，這種團簇的形成在具有高質(zhì)子親和力的化合物中尤為常見[18]。在本研究中，大多數(shù)醛、烯烴以及α-松油醇、芳樟醇、2-乙基呋喃、乙酸乙酯和乳酸乙酯都有雙峰。

表4 揮發(fā)性成分信息表Table 4 Volatile components information sheet

續(xù)表3

根據(jù)各類揮發(fā)性有機物的總量，繪制湘柑茶的香氣相對組成圖。如圖6所示，整體來看，烯烴(22.3%～29.2%)、醇類(19.3%～27.0%)和醛類(11.3%～15.3%)作為主要的芳香化合物在所有樣品中含量較多。隨著柑橘的成熟度的增加，湘柑茶的香氣中醇類、醛類、酯類、酮類和烯烴組分總量均逐步增加。江津津等[3]發(fā)現(xiàn)未成熟的果實制備的柑普茶的香氣中雜環(huán)化合物(5.8%)大于相對成熟的果實制備的柑普茶(3.4%)，與本研究中湘柑茶中隨著成熟度的提高，由雜環(huán)化合物和硫化物組成的其他組分香氣總量逐漸降低相一致。

圖6 湘柑茶的香氣相對組成Fig.6 The aroma of Xianggan tea is relatively composed

2.5.1.2 樣品間直觀差異性對比

采用風(fēng)味分析儀的Reporter插件程序生成二維譜圖(圖7)，以便對樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進行比較。縱坐標(biāo)表示保留時間，橫坐標(biāo)表示漂移時間，紅色垂直線表示反應(yīng)離子峰(reaction ion peak，RIP)，RIP兩側(cè)的每個點代表1種揮發(fā)性有機物。選擇以T1樣品的譜圖為參比，可直接比較不同處理果實的風(fēng)味物質(zhì)差異?？鄢尘昂笙嗤瑵舛鹊幕衔镱伾珵榘咨t色點表示化合物的濃度高于參比樣品，紅色越深表示濃度越高；而藍(lán)點則表示化合物的濃度低于參比樣品，藍(lán)色越深表示樣品濃度越低。由圖7可知，揮發(fā)性物質(zhì)聚集在0～1 000 s，主要分布在漂移時間1.0～1.5 ms。不同湘柑茶具有相似的揮發(fā)性物質(zhì)，但是濃度明顯不同。隨著成熟度的增加，湘柑茶的揮發(fā)性有機物的濃度逐漸降低，主要呈藍(lán)色。不同成熟度制備的湘柑茶的揮發(fā)性有機物可通過HS-GC-IMS技術(shù)很好地分離，且可直觀識別不同處理的揮發(fā)性物質(zhì)的差異。

圖7 湘柑茶的HS-GC-IMS差異對比圖譜Fig.7 The HS-GC-IMS differential and comparative map of Xianggan tea

2.5.1.3 揮發(fā)性指紋圖譜分析

由于二維光譜顯示了揮發(fā)性成分的全貌，很難準(zhǔn)確分析圖像中的重疊物質(zhì)。因此，根據(jù)所有的信號峰形成了湘柑茶的指紋圖譜(圖8)。在指紋圖譜中，每一行代表同一樣品的所有揮發(fā)性峰，每一列代表同一物質(zhì)在不同樣品中的信號峰。斑點的顏色從藍(lán)色到紅色不等，表明揮發(fā)性物質(zhì)的濃度從低到高。鑒定出的85個信號峰值用它們現(xiàn)有名稱進行標(biāo)記，數(shù)字代表IMS數(shù)據(jù)庫中沒有的未知物質(zhì)。

圖8 基于HS-GC-IMS的湘柑茶的指紋圖譜Fig.8 The fingerprint of Xianggan tea based on HS-GC-IMS

T1在A區(qū)域內(nèi)的揮發(fā)性物質(zhì)的含量比T2、T3多。揮發(fā)性物質(zhì)包括3種酯類：乙酸苯乙酯、乙酸乙酯和丁位辛內(nèi)酯;3種酮類：2-庚酮、2-己酮和2-丁酮，2-正己醇。其中，酯類主要來源于脂氧合酶途徑和氨基酸代謝，這些化合物大多表現(xiàn)出典型的果味或花味，與水果風(fēng)味的“果香”屬性有關(guān)。2-庚酮、2-己酮和2-丁酮都屬于具有特殊香氣的低碳飽和酮，大量存在于奶酪中[19]。B區(qū)域內(nèi)包括絕大部分的醛類，5種酮類，3種醇類，3種酯類，此外還有2,5-二甲基呋喃和2-乙基呋喃。這些物質(zhì)在T2中的含量均大于其他樣品。幾乎所有的醛類和酮類都被證明是香氣的重要組成部分，醛是次生代謝物，形成于柑橘成熟期間，并提供類似柑橘的水果味道。正己醛、壬醛、青葉醛和癸醛分別是C6、C9或C10醛，起源于多不飽和脂肪酸氧化后的產(chǎn)物被過氧化物裂解酶裂解的過程[20]，這是植物產(chǎn)生清香風(fēng)味成分的基本途徑。在水果的主要香氣成分中癸內(nèi)酯具有與桃子、甜牛奶相似的氣味，其生物合成與氧化途徑有關(guān)，如桃子中的β-癸內(nèi)酯、椰子中的γ-辛內(nèi)酯等[21]。金盆柚屬于雜交香橙品種，這是首次在金盆柚制成的衍生品中發(fā)現(xiàn)癸內(nèi)酯。

在指紋圖譜其他區(qū)域，芳樟醇、3-羥基-2-丁酮、三環(huán)烯、檸檬烯、蒎烯、月桂烯和α-水芹烯等化合物在所有樣品中均含量較高。鄭敏[22]研究表明柑普茶的外皮中烯烴類化合物的相對含量占87%以上，可見大量的萜烯類物質(zhì)在湘柑茶的整體香氣中起著關(guān)鍵作用。糖醛、2-乙?；秽?-甲基丁醛-單體在T3中含量最高，湘柑茶干燥過程中，呋喃和吡嗪類化合物通過在美拉德反應(yīng)中脫水脫氧醛糖降解氨基酸而產(chǎn)生[18]。除此之外，揮發(fā)性硫化物是重要的芳香誘導(dǎo)化合物，具有門檻低、氣味強的特點，廣泛分布于食品中。二甲基硫化物[23]被描述為一種蘆筍、玉米和糖蜜的香氣，被認(rèn)為是一種在低濃度下有益的化合物。湘柑茶中二甲基硫在T2中含量較多，二甲基二硫在T1中含量較多。此外，2-甲基丁醛、3-甲基丁醛是在茶葉加工過程中產(chǎn)生這些具有麥芽糖氣味的醛，可能是由于其母氨基酸纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸與偏二羰基化合物的反應(yīng)[24]，如氧化茶多酚或甲基乙二醛。

2.5.2.1 揮發(fā)性香氣成分的測定

由表5可知，3種湘柑茶中共檢測出115種香氣成分，其中酯類6種、醇類21種、酮醛類10種、烯類65種、烷類7種、酚類4種。目前江津津等[3]比較了4種柑橘果茶的揮發(fā)性香氣成分，也僅鑒定出42種揮發(fā)性成分，因此湘柑茶產(chǎn)生的香氣成分種類較其他柑橘制備的柑橘果茶多。香氣成分質(zhì)量濃度總量為T2>T1>T3。其中，烯類最多，醇類次之(圖9)。

圖9 湘柑茶中揮發(fā)性有機物的含量Fig.9 The content of volatile organic matter in the Xianggan tea

表5 HS-SPME-GC-MS技術(shù)測定湘柑茶中揮發(fā)性成分含量Table 5 Determination of volatile components in Xianggan tea by HS-SPME-GC-MS

續(xù)表4

酯類。酯類是柑橘中最重要的風(fēng)味成分之一，其主要來源于脂氧合酶途徑和氨基酸代謝，與果實風(fēng)味的果香屬性有關(guān)，其含量通常在成熟后期增加[25]。在6種酯類中，橙花乙酸酯和乙酸香葉酯同時存在于3種樣品中且含量較高，可見其對湘柑茶的整體香氣具有重要貢獻。除此之外，每種樣品具有獨特的酯類，比如醋酸辛酯、鄰氨基苯甲酸芳樟酯和反式-金合歡醇乙酸酯只存在于T2中，4-碳酸異丙苯丙炔酯僅存在于T1中。這些物質(zhì)可以作為它們的獨特分子標(biāo)記物。

醇類。共檢測到21種醇類物質(zhì)，其中芳樟醇、α-松油醇、(1R,5R)-香芹醇和樺木醇在所有樣品中均存在。這些醇類成分是湘柑茶在加工過程中碳?xì)漭葡┖推渌绑w的一系列氧化水合-脫水反應(yīng)形成的。芳樟醇是一種帶有花香的萜類酒精，它可以從香葉醇轉(zhuǎn)化為酶異構(gòu)，進而在酸性條件下芳樟醇可降解為α-松油醇[26](B7)。除T1樣品外，4-萜烯醇和桉油烯醇在其余樣品中均存在。這些單萜烯醇是茶樹產(chǎn)物的主要成分，即萜類醇及其氧化物是微生物發(fā)酵茶如普洱茶中的主要醇類[27]。

酮醛類。在湘柑茶樣品中檢出4種醛(C1～C4)和6種酮(C5～C10)。幾乎所有的醛類和酮類都被證明是影響香氣的重要因素，并且在發(fā)酵過程中顯著增加。醛類化合物廣泛存在于茶葉中，是構(gòu)成其整體香氣特征的主要揮發(fā)性基團之一。T2和T3中醛類含量和種類明顯高于T1。L-紫蘇醛同時存在于所有樣品中，它來源于肉桂酸的降解[28]。同樣，3種湘柑茶樣品具有不同的酮類，D-香芹酮是它們的共有化合物。BI等[29]發(fā)現(xiàn)，在熱加工過程中，D-香芹酮是檸檬烯的氧化產(chǎn)物，可以通過氧化途徑氧化相應(yīng)不飽和位點，使其含量顯著增加。

烯類。萜類化合物在柑橘果茶的香氣中起著重要的作用。本研究中，共鑒定出65種烯類，其中以單萜類化合物居多，3種湘柑茶中共有的烯類有18種。研究觀察到不同樣品之間烯類物質(zhì)的含量和種類存在顯著差異。其中D-檸檬烯是柑橘中的一種代表性化合物，具有最高的含量(115～300 μg/g)。先前的研究表明，D-檸檬烯作為增味劑，是柑橘類產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)志。在深加工過程中，D-檸檬烯可能被氧化成過氧化氫，過氧化氫進一步反應(yīng)生成大量產(chǎn)物，如香芹酮、鄰苯三酚和萜烯-4-醇等[28]。

酚類。湘柑茶樣品中含有香芹酚、百里酚、5,6,7,8-四氫-1-萘酚和3-甲基-4-異丙基苯酚這4種揮發(fā)性酚類化合物。香芹酚和百里酚是食品工業(yè)中重要的增味劑，廣泛存在于植物中，是鮮葉茶的重要酚類成分[27]。T2中香芹酚的含量最高達(dá)25.38 μg/g，同樣T3中百里酚的含量最高達(dá)25.86 μg/g。這表明不同的成熟度的金盆柚制備的湘柑茶的香氣具有顯著區(qū)別。

2.5.2.2 關(guān)鍵香氣化合物分析

消費者通常通過風(fēng)味來判斷食品的可接受性。湘柑茶中揮發(fā)性有機化合物的氣味活性是決定最終產(chǎn)品質(zhì)量的主要感官特征之一。為了尋找到湘柑茶中關(guān)鍵的香氣化合物，更準(zhǔn)確地確定各自揮發(fā)性成分對湘柑茶香氣的影響，本實驗采用了采用OAV來表征各香氣化合物對主體香氣成分的貢獻，分析探討3種樣品中的關(guān)鍵揮發(fā)性香氣物質(zhì)。OAV的水平可以反映化合物對樣品特征味道的貢獻。香氣化合物的OAV通過計算濃度除以氣味閾值來計算[30]。以往的研究表明，OAV>1表示其對樣品整體香氣的貢獻，OAV越高，化合物的個體貢獻越大。

由表6可知，湘柑茶的香氣化合物中OAV>1的物質(zhì)有27種。其中，酯類2種、醇類5種、酮醛類6種、烯類12種和酚類2種。其中，具有檸檬香氣的D-檸檬烯的OAV在3種樣品中均大于100，具有最高的香氣貢獻率。其中，除了上文提到的芳樟醇外，具有海桐花香氣的α-松油醇也對湘柑茶的香氣具有較大影響。(1R,5R)-香芹醇和(1R,5S)-香芹醇是由P450酶對檸檬烯的6-羥基化所形成的[31]。在微生物發(fā)酵過程中，糖苷通過水解和進一步氧化得到這些萜醇及其衍生物，并能提供柑橘茶的花香、甘甜和木香的香氣。酮是各種茶葉樣品中非常重要的香氣物質(zhì)，具有獨特的花香和木香。由于它們的閾值較低如β-紫羅酮(C10)等，所以極低的含量也可以影響樣品的整體香氣。在OAV>1的12種烯類物質(zhì)中，T1中種類最多達(dá)11種，T2有6種，T3有3種。其中有4種蒎烯的同分異構(gòu)體(D1、D5、D7和D10)具有松節(jié)油氣味。除了檸檬烯外，具有柑橘香的γ-萜品烯和具有丁香香氣的β-石竹烯對湘柑茶的整體香氣均有較顯著的影響。然而，具有啤酒花香氣的α-律草烯和具有黑胡椒、藹荷似香氣的α-水芹烯僅存在于T1的香氣中。

表6 湘柑茶的關(guān)鍵香氣化合物的OAV值Table 6 OAV values of key aroma compounds in Xianggan tea

續(xù)表6

由此可知，3種湘柑茶中均含有柑橘果茶的主體性香氣成分，但也有各自獨有的香氣成分，存在特異性差異。

2.6 感官評價

由圖10可知，3種湘柑茶沖泡后茶葉形態(tài)良好，柑皮與茶葉包裹較緊密，茶湯均勻。湯色評分較高的為T1和T2，其顏色橙紅明亮，T3的湯色則欠亮。香氣評分最高的湘柑茶為T2，達(dá)21.6分，其柑橘香、茶香濃郁，優(yōu)雅協(xié)調(diào)，而T3的香氣不足。滋味得分的結(jié)果和湯色一致，T1最高，T2次之，T3最低。T1的滋味醇厚，細(xì)膩滋潤，回味良好。綜合感官得分最高的為T2，其湯色紅濃明亮，滋味較醇厚，柑橘香、茶香協(xié)調(diào)較良好，口感良好，總分為67.8，其次為T1，總分達(dá)66.1。

圖10 感官評價雷達(dá)圖Fig.10 Sensory evaluation radar map

2.7 不同成熟度柑橘制備的湘柑茶品質(zhì)綜合分析

主成分分析(principal component analysis, PCA)是一種利用降維技術(shù)將多個變量轉(zhuǎn)化為主成分的統(tǒng)計方法，是最重要的降維方法之一。KESEN等[33]通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，不同地理產(chǎn)地的土耳其橄欖油的香氣特征存在明顯差異。本研究采用主成分分析法對不同成熟度的金盆柚制備的湘柑茶綜合品質(zhì)進行分析。

如圖11-a所示，將湘柑茶的加工特性、TF、TP、橙皮苷、柚皮苷、感官評價和27種關(guān)鍵香氣化合物(OAV>1)的含量共33個指標(biāo)進行PCA分析，結(jié)果顯示，共提取到11個主成分。第一個主成分貢獻率為55.3%，前2個主成分的特征值均大于1，累計方差貢獻率達(dá)到95.07%。T1、T2和T3分別位于第二象限、第一象限和第四象限。不同湘柑茶樣品樣本可以很好地區(qū)分，說明其綜合品質(zhì)具有顯著差異。

a-PCA得分圖；b-雙重信息圖圖11 湘柑茶品質(zhì)的主成分分析Fig.11 The principal component analysis from the quality characteristics of Xianggan tea

為了獲得更多細(xì)節(jié)，使用了雙重信息圖(圖11-b)。水平和垂直坐標(biāo)為主成分，每個向量代表原始特征。向量在主成分上的投影可以表示兩者之間的相關(guān)程度。由圖中可以清楚地看出，這些指標(biāo)對不同的湘柑茶樣品的影響是不同的。其中TF和烯類香氣物質(zhì)與T1的綜合品質(zhì)呈正相關(guān)，這與它們的含量在T1中最高相一致。同樣，胡椒酮、4-萜烯醇、柚皮苷和加工品質(zhì)等對T3的綜合品質(zhì)也有顯著貢獻。值得注意的是，TP、感官品質(zhì)和大部分的醇類、酯類、酮醛類均投影在第一象限內(nèi)，構(gòu)成了T2綜合品質(zhì)的重要指標(biāo)。綜上所述，不同指標(biāo)對湘柑茶綜合品質(zhì)的影響的大小與指標(biāo)的高低相一致，不同成熟度金盆柚制備的湘柑茶綜合品質(zhì)具有顯著差異。

3 結(jié)論

本研究對不同成熟度的金盆柚制備的湘柑茶進行了加工品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)、香氣品質(zhì)和感官品質(zhì)的綜合評價。結(jié)果顯示，T3的加工特性最佳，挖果容易且成品形態(tài)良好。T2的感官評價最優(yōu)，柑皮和茶葉的香氣協(xié)調(diào)性較好，口感良好，接受度較高。營養(yǎng)品質(zhì)中TF和橙皮苷在T1柑皮中含量最高分別達(dá)9.2和12.49 mg/g，且其含量隨果實成熟度的增加呈現(xiàn)降低趨勢，柚皮苷的變化則呈相反趨勢；TP在T2中含量最高達(dá)8.4 mg/g，其含量隨成熟度呈先增加后減少的趨勢。通過HS-GC-IMS技術(shù)結(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析湘柑茶香氣品質(zhì)，分別鑒定出64種和115種香氣成分，主要有烯烴類、酯類，醇類、酮醛類和酚類。通過OAV計算，篩選出27種關(guān)鍵香氣化合物，不同湘柑茶中均含有共同的主體性香氣成分如D-檸檬烯、芳樟醇、α-松油醇和β-石竹烯等，但也有各自獨有的香氣成分，這些化合物具有果香、花香、松柏木香等典型的植物香氣，構(gòu)成了湘柑茶的整體風(fēng)味。最后主成分分析顯示，3種湘柑茶的綜合品質(zhì)存在顯著差異。

湖南是柑橘和茶葉資源大省，湘柑茶對于聯(lián)合湖南省內(nèi)過剩的柑橘和茶葉資源，開發(fā)柑橘加工新產(chǎn)品提供了參考。由于本實驗僅重點考察了金盆柚的不同果實成熟度對湘柑茶綜合品質(zhì)的影響，后續(xù)可進一步開展加工工藝優(yōu)化和風(fēng)味形成規(guī)律研究，通過加工過程實現(xiàn)對湘柑茶品質(zhì)的控制，為湘柑茶的規(guī)范生產(chǎn)提供可靠的技術(shù)支撐。