肖 鑫 李 鵬 施田力 江玉立

湖州市中心醫(yī)院，湖州師范學院附屬中心醫(yī)院泌尿外科（浙江湖州313000）

前列腺癌（prostate cancer,PC）是男性較為常見的腫瘤，并且是全世界男性第三大癌癥死亡的主要原因[1,2]。盡管雄激素受體（androgen Receptor,AR）靶向療法在臨床上取得了成功，但AR信號的重新激活仍然是去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC）進展的主要驅(qū)動力[3]。目前已經(jīng)證明鐵的毒性抑制癌細胞的生長，同樣地，鐵穩(wěn)態(tài)已被證明在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起作用[4]。鐵死亡（Ferroptosis）是2012年定義的一種鐵依賴性和非凋亡性細胞死亡形式。Erastin作為促鐵死亡的誘導劑，可以誘導鐵死亡，抑制多種癌癥中惡性細胞的增殖，但其在CRPC中尚缺乏深入的研究[4]。本研究中，我們假設(shè)鐵死亡誘導劑Erastin誘導的鐵死亡對CRPC細胞是有毒性，并探索其潛在的機制。

材料

一、實驗細胞

CRPC細胞系22Rv1和VCaP來源于中國科學院(上海)模式培養(yǎng)庫。細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清(Gibco)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、主要藥物及試劑

鐵死亡誘導劑Erastin試劑、特異性鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1（Lip-1，#S7699）和Ferrostatin-1（Fer-1，#S7243）購自Selleck。caspase抑制劑Z-VAD-FMK（#V116），鐵螯合劑去鐵胺deferoxamine（DFO，#D9533），壞死抑制劑（Necrosulfonamide,Necro-1）、自噬抑制劑氯喹chloroquine（#C6628），二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）從Sigma獲得。胎牛血清fetal bovine serum,FBS（#184590）購自Corille。一抗谷胱甘肽過氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4,GPX4）（ab125066）和AR是從Abcam購買的；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPD）（#5174）從Cell Signaling Technology（CST）獲得。BCA(Bicinchoninic acid)蛋白測定試劑盒、放射免疫沉淀（Radioimmunoprecipitation,RIPA）裂解緩沖液以及核和細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)。AR表達質(zhì)粒（LY400012）購自O(shè)riGene。谷胱甘肽（glutathione,GSH）（#A061-2）和脂質(zhì)過氧化物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）（#E-11325）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

方 法

一、實驗細胞分組處理

CRPC細胞系22Rv1和VCaP以70～80%的融合率傳代培養(yǎng)，所有實驗都以指數(shù)生長期的細胞進行。CRPC細胞分為對照組、erastin（10μM）和erastin+Lip（1 μM）組，對照組和erastin（10μM）組分別用含有或不含有erastin（10μM）的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，erastin+Lip（1μM）組在erastin（10μM）的基礎(chǔ)上再加1μM Lip的培養(yǎng)基培養(yǎng)，加藥物培養(yǎng)24 h后，開展后續(xù)實驗。

二、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)

分別加入100μl不同濃度 （0、5、10、20、40μM）Erastin培養(yǎng)6、12、24和48 h，每孔加入20μl MTT溶液孵育4h，使用酶標儀測定490 nm處吸光度。

設(shè)置對照組、Erastin（10μM）、Erastin+DFO（100μM）、Erastin+Fer-1 （1μM）、Erastin+Lip （1μM）、Erastin+Necro-1（10μM）、Erastin+Z-VAD-FMK（10μM）和Erastin+chloroquine（25μM），培養(yǎng)24 h，細胞活力測定基本方法同上，分別測定吸光度。

三、流式細胞儀測定可變鐵池(Labile Iron Pool,LIP)

根據(jù)制造商說明書中描述的方法測量LIP（可變鐵池）[5]，細胞經(jīng)胰酶消化，用0.5ml磷酸鹽洗滌兩次，以1×106/ml的密度在37°C下與0.05μM鈣黃綠素-乙酰氧甲酯(AnaSpec)孵育15 min。然后，用0.5ml的PBS洗滌細胞兩次，加或不加去鐵胺(100μM)在37°C孵育1h，用流式細胞儀對細胞進行分析，鈣黃綠素的激發(fā)波長為488 nm，熒光強度為525 nm。有無去鐵胺孵育的細胞平均熒光的差異反映了LIP值。

四、生化法檢測GSH、MDA

分別使用GSH和脂質(zhì)過氧化測定試劑盒根據(jù)說明書要求評估細胞裂解物中的GSH和MDA含量。

五、AR表達質(zhì)粒及其轉(zhuǎn)染

用MegaTran 1.0轉(zhuǎn)染試劑(OriGene)將AR表達質(zhì)?；蚩蛰d體瞬時轉(zhuǎn)染CRPC細胞系22Rv1和VCaP 36 h。然后，收集細胞進行進一步研究。

六、Western blot檢測

使用RIPA裂解緩沖液進行蛋白質(zhì)印跡獲得蛋白裂解物，用核質(zhì)蛋白提取試劑盒提取細胞室蛋白，BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺 （sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide，SDS-PAGE）凝膠分離總共20μg的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜(微孔)上。將膜與下列特異性一抗孵育：AR、GPX4和GAPDH，GAPDH用作內(nèi)對照。加二抗，ECL顯影。

七、實時定量PCR

用TrizolTM試劑提取總RNA，利用GoScriptcDNA反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(PROMEGA)合成約1μg RNA。使用Go-TaqRqPCR Master Mix(Promega)進行qPCR。相應(yīng)靶基因的引物如下：AR.5-GAC GAC CAG ATG GCT GTC ATT-3(forward).5-GGG CGA AGT AGA GCA TCC T-3(reverse).GAPDH.5-TTC TTT TGC GTC GCC AGC CGA-3(forward).5-GTG ACC AGG CGC CCA ATA CGA-3(reverse).

八、統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)以三個獨立實驗的平均值±SD表示，并使用GraphPad Prism 5.0軟件進行分析。組間差異的顯著性通過單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)進行。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、Erastin對CRPC細胞活力的抑制作用

為了確定鐵死亡誘導劑Erastin是否對CRPC細胞有影響，將不同劑量的Erastin分別加入CRPC細胞系22Rv1和VCaP中，采用不同的孵育時間來檢測這種時間依賴效應(yīng)。如圖1所示，Erastin以劑量依賴和時間依賴的方式抑制22Rv1和VCaP的細胞活力（P＜0.05）。

圖1 Erastin對CRPC細胞活力的抑制作用

二、特異性鐵死亡抑制劑阻止Erastin誘導的細胞生長抑制

為了進一步確定鐵死亡在Erastin誘導的細胞活力抑制中的作用，在加或不加幾種細胞死亡抑制劑的情況下，用鐵死亡誘導劑Erastin處理CRPC細胞，聯(lián)合使用鐵螯合劑DFO、特異性鐵死亡抑制劑可以阻止Erastin誘導的細胞生長抑制（P＜0.001），而凋亡、壞死與自噬抑制劑沒有這種作用(圖2)，這些數(shù)據(jù)提示鐵死亡可能與鐵死亡誘導劑Erastin誘導的CRPC細胞生長抑制有關(guān)。

圖2 特異性鐵死亡抑制劑阻止Erastin誘導的細胞生長抑制

三、Erastin對CRPC細胞鐵死亡的促進作用

鐵死亡誘導劑Erastin促進鐵死亡相關(guān)性LIP增加(P＜0.001,圖3)，鐵死亡重要調(diào)節(jié)因子GPX4蛋白表達和細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)因子GSH水平均下調(diào)(P＜0.001,圖4A-B)，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA顯著增加，而在鐵死亡抑制劑Lip使用后逆轉(zhuǎn)(P＜0.001)，這些結(jié)果提示鐵死亡誘導劑Erastin對CRPC細胞鐵死亡的促進作用。

圖3 Erastin促進鐵死亡相關(guān)性LIP增加

圖4 Erastin促進鐵死亡A：GPX4蛋白表達；B：GSH水平；C：MDA水平

四、Erastin對CRPC細胞中AR的抑制作用

鐵死亡誘導劑Erastin降低了AR的表達水平，而特異性鐵死亡抑制劑則增加了AR的蛋白和mRNA表達水平（P＜0.01,圖5A-B）。

圖5 Erastin對CRPC細胞中AR的抑制作用A：AR蛋白表達；B：AR mRNA表達水平

五、AR上調(diào)對Erastin生長抑制的逆轉(zhuǎn)作用

為了進一步驗證鐵死亡與AR之間的作用，本研究調(diào)查了AR的過表達是否逆轉(zhuǎn)鐵死亡誘導劑Erastin的細胞生長抑制作用。Western印跡證實了AR質(zhì)粒的成功轉(zhuǎn)染（P＜0.01,圖4A），AR的過表達顯著減弱了Erastin的細胞活力抑制作用（P＜0.01,圖4B）。

圖6 AR上調(diào)對Erastin生長抑制的逆轉(zhuǎn)作用A：AR蛋白表達；B：細胞活力

討論

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鐵死亡可以抑制肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和其他癌癥中的惡性細胞的增殖[4,6,7]。特別是一些高度惡性的癌細胞被證明對鐵死亡具有先天易感性，因此誘導鐵死亡可能成為一種新的癌癥治療方法[8]。

鐵死亡誘導劑Erastin可以觸發(fā)多個分子，效果高效、快速和持久，而其他鐵死亡誘導劑通常只觸發(fā)一條途徑[9]。由于可以誘導自然的非凋亡形式，基于Erastin的癌癥治療有望繞過由凋亡介導的傳統(tǒng)療法的缺點。鐵死亡觸發(fā)的Erastin可以克服急性髓系白血病細胞對化療藥物的耐藥性[10]。然而，鐵死亡在CRPC中的作用仍不清楚，本研究結(jié)果提示Erastin以劑量依賴的方式誘導CRPC細胞的生長抑制，并且能夠被特異性鐵死亡抑制劑逆轉(zhuǎn)，而凋亡、壞死與自噬抑制劑沒有這種作用，這進一步證明了Erastin作為列腺癌新治療策略的潛力，且可能與誘導鐵死亡有關(guān)[11]。

鐵是包括活性氧生成反應(yīng)與鐵死亡等許多生物過程中必不可少的元素。據(jù)報道，LIP可以通過直接催化活性氧的產(chǎn)生從而促進鐵死亡[12]。與此一致，我們的結(jié)果提示Erastin促進鐵死亡所致的LIP增加。此外，鐵死亡受到GPX4和一些鐵轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)[13]。GPX4是最重要的抗氧化酶之一，也是癌細胞鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子。目前的研究表明，GPX4的激活可以抑制鐵死亡和炎癥[14]。與這些報道一致的是，我們的研究表明Erastin可以抑制GPX4的表達和GSH水平，且上調(diào)了MDA水平。細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)因子GSH和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA在維持細胞氧化還原平衡中起重要作用[13]。鐵死亡在生化代謝方面主要表現(xiàn)是離子的鐵沉積導致膜脂質(zhì)過氧化和過度的氧化應(yīng)激損傷的細胞內(nèi)氧化還原平衡，一起降低抗氧化能力和增加細胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧，最終導致氧化細胞死亡。

研究顯示一些致癌途徑與鐵死亡密切相關(guān)，從而使癌細胞對鐵死亡極為敏感[4]。盡管多年來AR一直是激素治療的主要靶點，但其仍然是前列腺癌進展為CRPC的關(guān)鍵驅(qū)動力。最近臨床選擇性ARI在提高CRPC患者存活率方面的成功進一步強化了雄激素受體作為治療靶點的重要性[3]。我們的研究表明Erastin可以抑制AR的表達，這可能在Erastin誘導的鐵死亡中起關(guān)鍵作用，過表達AR導致Erastin處理后細胞增殖增加，因此，AR可能是Erastin誘導的鐵死亡的關(guān)鍵決定因素。

綜上所述，AR的過表達逆轉(zhuǎn)誘導鐵死亡后細胞增殖的抑制作用，AR在去勢抵抗性前列腺癌細胞鐵死亡中的起著重要作用，更詳細的作用機制有待進一步研究。