張景寧，李小軍，盛定紅，王應(yīng)蘭，吉 俐，董麗敏，謝承衛(wèi)

（貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

我國(guó)作為煤炭開(kāi)采大國(guó)，在煤炭開(kāi)采過(guò)程中產(chǎn)生大量煤矸石，煤矸石通常堆存處置，未得到有效利用。這不僅會(huì)造成土地資源的浪費(fèi)，還會(huì)污染環(huán)境［1］。以煤矸石作為原料制備微生物肥料，不僅可以提高作物產(chǎn)量，還能改善作物品質(zhì)，降低病蟲害發(fā)生率，保護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境等［2］。

當(dāng)前，煤矸石微生物肥料主要是以煤矸石為原料，采用單一解磷微生物制備［3］。此方法雖然提高了肥料中有效氮磷鉀含量，能提高農(nóng)作物產(chǎn)量［4］，但對(duì)農(nóng)作物的品質(zhì)改善不顯著［5］，且對(duì)煤矸石中磷的解離效率較低，煤矸石肥料中w（有效磷）在118～185 mg/kg［6-7］。而有研究表明磷石膏可以降低土壤堿性［8］，間接地影響農(nóng)作物的品質(zhì)［9］。向煤矸石中摻雜磷石膏可以調(diào)整煤矸石的酸堿度，提升解磷菌對(duì)煤矸石的解磷效果。目前鮮有利用解磷菌處理?yè)诫s磷石膏的煤矸石制備肥料的研究報(bào)道。本研究主要目的是探究磷石膏對(duì)煤矸石微生物肥料養(yǎng)分含量的提升效果。

1 材料和方法

1.1 菌種

研究所用的GZU-art01菌株是從廢棄煤渣草坪根際土壤提取，經(jīng)過(guò)分離、培育、篩選而得到。

1.2 煤矸石和磷石膏樣品

1.2.1 煤矸石

研究所用煤矸石來(lái)自貴州省六盤水市煤矸石堆場(chǎng)，其主要成分見(jiàn)表1。

表1 煤矸石中主要礦物成分［6］ %

1.2.2 磷石膏

研究所用磷石膏為陳舊磷石膏，來(lái)自開(kāi)陽(yáng)磷礦磷石膏尾礦壩，pH約為4.2。由于磷石膏的pH過(guò)低，直接用細(xì)菌處理，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌存活率降低，故將磷石膏摻入煤矸石中再用細(xì)菌處理，以確保細(xì)菌的存活率。

1.3 方法

1.3.1 菌株提取分離

初篩：用無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基進(jìn)行初篩。

復(fù)篩：以商業(yè)菌株巨大芽孢桿菌為對(duì)照菌株，用沙培法進(jìn)行復(fù)篩，篩選出解磷效果好的菌株。

1.3.2 菌株鑒定

提取GZU-art01菌株的總DNA，并將其通過(guò)引物進(jìn)行菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（即PCR擴(kuò)增反應(yīng)）［9］，反應(yīng)條件見(jiàn)表2。

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

將獲得的PCR產(chǎn)物寄送至測(cè)序公司進(jìn)行DNA序列測(cè)試。測(cè)序結(jié)果在NCBI基因庫(kù)中對(duì)比分析基因序列，使用MEGA5.05軟件基于鄰接法構(gòu)建GZU-art01菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并結(jié)合細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定種。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）確定磷石膏的最佳摻比：按不同比例分別稱取煤矸石和磷石膏樣品，共計(jì)10 g。其中0表示純煤矸石樣品，100%表示純磷石膏樣品，測(cè)量摻入磷石膏后煤矸石中的有效磷含量。

（2）細(xì)菌的耐酸耐堿實(shí)驗(yàn)：將細(xì)菌接種于不同pH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)（24±2）h后，用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，在600 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行光電比濁測(cè)定，得出細(xì)菌在不同pH下的存活情況。

1.3.4 煤矸石肥料的制備

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定因素的變化范圍，設(shè)計(jì)GZU-art01菌株的L9（4）3正交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到菌株處理煤矸石和摻雜磷石膏的煤矸石的最優(yōu)條件，以此來(lái)制備煤矸石肥料。將菌株GZU-art01接種于LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期末期后取出。然后在培養(yǎng)基中加入適量無(wú)菌水，用L型玻璃棒刮洗，將細(xì)菌制成菌懸液。GZUart01菌株菌懸液濃度調(diào)節(jié)至最優(yōu)條件，將菌懸液與10 g煤矸石和摻雜30%磷石膏的煤矸石混勻，并用1 mol/L HCl和NaOH調(diào)節(jié)體系pH，放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，取出于35℃烘干。

1.3.5 煤矸石肥料中有效氮磷鉀含量的測(cè)定

按照《土壤分析技術(shù)規(guī)范》［10］中方法對(duì)經(jīng)細(xì)菌處理過(guò)的煤矸石及摻雜磷石膏的煤矸石進(jìn)行養(yǎng)分測(cè)定，包含有效磷、速效鉀、水解氮。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)、菌體形態(tài)

GZU-art01菌株在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)如圖1所示。

圖1 GZU-art01菌株的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)

從圖1可知，GZU-art01菌株在LB固體培養(yǎng)基中的菌落為米黃色，不透明，菌落形態(tài)呈橢圓形，較濕潤(rùn)。通過(guò)革蘭氏染色在顯微鏡下觀察，菌體較細(xì)，無(wú)芽孢，鑒定為革蘭氏陽(yáng)性菌。細(xì)菌的掃描電鏡圖像顯示細(xì)菌形態(tài)為短桿狀，長(zhǎng)度約1.8μm，菌體表面有細(xì)微螺旋狀褶皺。

2.1.2 細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)

對(duì)GZU-art01菌株進(jìn)行一系列生理生化鑒定（均用微生物生化鑒定管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)），其結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 GZU-art01菌株的生理生化特性

2.1.3 GZU-art01菌株的16SrRNA鑒定

根據(jù)DNA序列檢測(cè)結(jié)果，構(gòu)建的GZU-art01菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖2所示，GZU-art01菌株與節(jié)細(xì)菌屬Arthrobacter bambusae KF150696在同一個(gè)分支上，具有較高的同源性，結(jié)合細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，挑選的菌株為Arthrobacter bambusae。

圖2 GZU-art01菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 磷石膏的最佳摻比

不同磷石膏摻比下，煤矸石有效磷含量的變化見(jiàn)圖3。

圖3 摻入不同比例磷石膏后煤矸石的有效磷含量

從圖3可知，在磷石膏摻比為30%時(shí)，煤矸石有效磷含量最高，故確定磷石膏摻比為30%。

2.2.2 細(xì)菌的耐酸耐堿實(shí)驗(yàn)

菌株的耐酸耐堿性如圖4所示。由圖4可知，提取出的細(xì)菌在pH為6和7時(shí)，細(xì)菌活性較好，更利于對(duì)煤矸石中磷的解離。

圖4 GZU-art01菌株的耐酸耐堿性

2.3 菌株解離煤矸石制備肥料

煤矸石中的磷主要以難溶形式的礦物存在，GZU-art01是一株好氧型解磷菌，能夠?qū)⒚喉肥械牧邹D(zhuǎn)化為可供植物吸收的有效磷。煤矸石的粒徑、體系pH、細(xì)菌接種量及培養(yǎng)時(shí)間均能影響解磷效果。因此，設(shè)計(jì)如下正交實(shí)驗(yàn)以探究GZU-art01處理煤矸石和摻雜磷石膏的煤矸石的最佳條件。

2.3.1 GZU-art01菌株解離煤矸石的正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

分別用GZU-art01菌株處理煤矸石和摻雜30%磷石膏的煤矸石，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 GZU-art01菌株處理煤矸石的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

據(jù)表4、表5可知，用GZU-art01菌株處理煤矸石的最佳條件為：pH=6.5，細(xì)菌接種量為9.730×107～1.278×108cfu/mL，煤矸石粒徑為0.250 mm，培養(yǎng)時(shí)間為1 d。各因素對(duì)結(jié)果的影響：細(xì)菌接種量＞培養(yǎng)時(shí)間＞煤矸石粒徑＞pH。處理?yè)诫s30%磷石膏的煤矸石的最佳條件為：pH=7.0，細(xì)菌接種量8.340×107～1.095×108cfu/mL，煤矸石粒徑為0.250 mm，培養(yǎng)時(shí)間為3 d。各因素對(duì)結(jié)果的影響：培養(yǎng)時(shí)間＞煤矸石粒徑＞細(xì)菌接種量＞pH。對(duì)比可知在適宜細(xì)菌（GZU-art01）生存的pH條件下，摻雜磷石膏后培養(yǎng)時(shí)間對(duì)煤矸石解磷效果的影響增加，細(xì)菌接種量對(duì)煤矸石解磷效果的影響降低，這也從側(cè)面說(shuō)明摻入磷石膏能夠促進(jìn)煤矸石中磷的解離。

表5 GZU-art01菌株處理?yè)诫s30%磷石膏的煤矸石的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 煤矸石肥料的制備及肥效指標(biāo)測(cè)定

分別測(cè)定最佳工藝條件下，GZU-art01菌株處理煤矸石和摻雜30%磷石膏的煤矸石制備微生物肥料中的氮磷鉀含量，結(jié)果如圖5所示。圖中的“原樣”是未經(jīng)任何處理的煤矸石樣品；“煤矸石”表示經(jīng)GZU-art01菌株處理的煤矸石肥料；“后摻”表示用細(xì)菌處理煤矸石后再摻雜30%磷石膏制得的煤矸石肥料；“先摻”表示先摻雜30%磷石膏再用細(xì)菌處理制得的煤矸石肥料。

圖5 煤矸石肥料中氮磷鉀含量

由圖5可知，相比于未經(jīng)細(xì)菌處理的煤矸石樣品，GZU-art01處理過(guò)的煤矸石肥料、細(xì)菌處理后摻雜磷石膏的煤矸石肥料、摻雜磷石膏后用GZUart01菌株處理的煤矸石肥料水解氮、有效磷、速效鉀均有較大提升。其中先摻雜磷石膏后用細(xì)菌處理制作肥料的方法，對(duì)提升煤矸石肥料中的氮磷鉀含量最顯著，較煤矸石原樣分別提升6.52倍、19.41倍、2.46倍，均高于后摻磷石膏和單一細(xì)菌處理的煤矸石肥料。

3 結(jié)論

（1）利用GZU-art01菌株處理煤矸石制備肥料，能夠提升肥料中氮磷鉀含量。（2）當(dāng)磷石膏摻比量為30%時(shí)，有效磷含量最高。（3）先摻雜磷石膏后用GZU-art01細(xì)菌處理來(lái)制備肥料的方法，對(duì)煤矸石肥料中的氮磷鉀含量提升最顯著，較煤矸石原樣分別提升6.52倍、19.41倍、2.46倍。（4）摻雜磷石膏可以提升解磷菌對(duì)煤矸石的解磷效率，不僅提升煤矸石肥料中的有效氮磷鉀含量，還能提高煤矸石微生物肥料的品質(zhì)。這也是對(duì)煤矸石和磷石膏資源化利用的一種新方式。