黃從書 朱貴花 劉桂芳 謝光輝 馬增春 高 月

1（廣東藥科大學(xué) 廣州 510006）

2（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

3（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京 100850）

放射性皮膚損傷是指全身或局部受到一定劑量的某種射線照射后所產(chǎn)生的皮膚損傷，具有潛伏性、遷延性、反復(fù)性和難愈性等特點(diǎn)。放射單獨(dú)治療或作為手術(shù)的輔助治療是頭頸癌、皮膚癌、肛門癌和乳腺癌最有效的治療方法之一，但常見(jiàn)的副作用，皮膚損傷，限制了其更廣泛的應(yīng)用［1］。

皮膚作為機(jī)體抵御外界刺激的第一道防線，對(duì)于機(jī)體保護(hù)具有重要意義，人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（Human keratinocytes，HaCaT）是皮膚表皮層中的主要細(xì)胞類型，約占表皮細(xì)胞總數(shù)的95%，是表皮的主要構(gòu)成細(xì)胞［2］。HaCaT細(xì)胞是一種自發(fā)永生的人類角質(zhì)形成細(xì)胞系，已被廣泛用于皮膚生物學(xué)和分化研究，它不僅有物理性保護(hù)屏障作用，而且還參與免疫、炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)化等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，可以很好模擬皮膚細(xì)胞的生理病理過(guò)程［3］。因此HaCaT細(xì)胞適宜于作為建立放射性皮膚損傷的細(xì)胞模型。

有研究表明，放射性皮膚損傷的病理效應(yīng)是由于基底層和真皮層的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的損失以及通過(guò)各種炎癥介質(zhì)導(dǎo)致炎癥過(guò)程的多細(xì)胞相互作用造成的，但是其損傷的機(jī)理仍不清楚［4］。目前的研究多以臨床實(shí)際病例為主，個(gè)體化差異性大，無(wú)法進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)，治療藥物匱乏，無(wú)特效藥物和救治標(biāo)準(zhǔn)［5］。目前關(guān)于放射性皮膚損傷的細(xì)胞生物學(xué)研究和分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢，細(xì)胞模型構(gòu)建研究較少。因此，建立有效的細(xì)胞模型，研究放射性皮膚損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered salinne，PBS）、青鏈霉素混合液（Penicillin-streptomycin solution）（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清（四季青，杭州）；Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、β-actin抗體（CST，美國(guó)）；凋亡檢測(cè)試劑盒、CCK-8試劑盒、SOD試劑盒（北仁化學(xué)，日本）；MDA試劑盒（南京建成）。

1.2 儀器與放射源

流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；顯影儀（Image Quant Las500型，Health care，瑞典）；酶標(biāo)儀（PE Victor型，PerkinElmer，美國(guó)）；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD，美國(guó)）。60Coγ射線照射源為軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所提供，單次吸收劑量率為100.68 cGy/min。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT由軍事醫(yī)學(xué)研究院周文霞教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。HaCaT細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞貼壁情況，每天換一次液，每3 d傳一次代。

1.3.2觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

將HaCaT細(xì)胞按照1×105mL?1的濃度接種到50 mL的培養(yǎng)瓶中，每瓶細(xì)胞5×105個(gè)。培養(yǎng)過(guò)夜后，以0 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy、24 Gy吸收劑量進(jìn)行照射，在照后6 h、24 h、48 h進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.3CCK-8法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞活力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105mL?1，以每孔100μL接種于96孔板中培養(yǎng)，待80%細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和吸收劑量不同，將HaCaT細(xì)胞分為0 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy、24 Gy劑量組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行60Coγ射線照射，照射后分別培養(yǎng)6 h、24 h、48 h，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。在相應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，每孔加入10μL CCK-8試劑，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值，計(jì)算不同吸收劑量后不同孵育時(shí)間HaCaT細(xì)胞的活力改變，見(jiàn)式（1）。每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次。

式中：C為細(xì)胞活力，%；As為含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測(cè)物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)孔的吸光度值；Ac為含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒(méi)有待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照孔的吸光度值；Ab為不含細(xì)胞和待測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8的空白孔的吸光度值。

1.3.4脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)

用細(xì)胞刮刀收集依據(jù)1.3.2節(jié)中培養(yǎng)照射過(guò)后不同時(shí)間段的HaCaT細(xì)胞，處理細(xì)胞樣本，根據(jù)MDA檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)脂質(zhì)氧化水平。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中MDA含量。

1.3.5超氧化物歧化酶(SOD)活力檢測(cè)

用細(xì)胞刮刀收集依據(jù)1.3.2節(jié)中培養(yǎng)照射過(guò)后不同時(shí)間段的HaCaT細(xì)胞，處理細(xì)胞，根據(jù)SOD檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)SOD抑制率，得出相應(yīng)SOD活力變化，見(jiàn)式（2）。

式中：Y為SOD抑制率，%；Aa為不含抑制劑的空白對(duì)照的吸光度值；Ab為樣品空白對(duì)照的吸光度值；Ac為試劑空白對(duì)照的吸光度值；Ax為不同待測(cè)樣品的吸光度值。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將HaCaT細(xì)胞依照1.3.2節(jié)處理細(xì)胞后，吸取培養(yǎng)瓶中的上清液到15 mL離心管中保存，用PBS洗細(xì)胞兩次并收集清洗液，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞液、上清液和清洗液一并加入15 mL離心管，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，重復(fù)一次，依次加入檢測(cè)凋亡試劑，1 h內(nèi)檢測(cè)。

1.3.7Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

將HaCaT細(xì)胞照射6 Gy、12 Gy、18 Gy、24 Gy吸收劑量后，培養(yǎng)24 h，提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)Caspase-3、Bax、Bcl-2凋 亡 蛋 白 和NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18炎癥因子蛋白表達(dá)的變化情況。按照BCA試劑盒說(shuō)明書對(duì)提取的全蛋白進(jìn)行蛋白定量，每個(gè)樣孔加入20μg蛋白樣品，以10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉3 h，選擇對(duì)應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，再次洗膜后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)法（ECL）顯影。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）和GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HaCaT細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)

與未照射組相對(duì)比，隨著吸收劑量的增大和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HaCaT細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞體積變小，發(fā)生皺縮變形，細(xì)胞間黏附降低（圖1）。照后48 h，細(xì)胞變化差異變小，可能與其損傷修復(fù)有關(guān)。

圖1 60Coγ射線照射后的HaCaT細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(100×)Fig.1 Morphological changes of HaCaT cells after 60Coγ-ray irradiation(uncolored 100×)

2.2 60Coγ射線照射對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

60Coγ射線會(huì)對(duì)HaCaT細(xì)胞造成損傷，從而影響細(xì)胞活力。與對(duì)照組相比，隨著吸收劑量的增加，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞的損傷加重（圖2）。當(dāng)吸收劑量為18 Gy時(shí)，在照射細(xì)胞后24 h，與對(duì)照組相比，HaCaT活力下降至57.50%，降低顯著，能夠作為檢測(cè)藥物對(duì)其損傷逆轉(zhuǎn)的重要指標(biāo)，因此該吸收劑量和培養(yǎng)時(shí)間適宜作為放射性皮膚損傷HaCaT細(xì)胞模型的條件。

圖2 60Coγ射線照射后的HaCaT細(xì)胞活力變化(與對(duì)照組比較，*,#,&p＜0.05,**,##,&&p＜0.01,***,###,&&&p＜0.001,±s,n=6)Fig.2 Cell viability changes of HaCaT cells after 60Coγ-ray irradiation(compared with the control group,*,#,&p＜0.05,**,##,&&p＜0.01,***,###,&&&p＜0.001,±s,n=6)

2.3 60Coγ射線對(duì)MDA含量和SOD活性影響

隨著吸收劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡被打破，與對(duì)照組相比，超氧化物歧化酶MDA含量升高，且隨著SOD抑制率升高，活性降低，細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷明顯（圖3）。

圖3 HaCaT細(xì)胞在照射不同吸收劑量24 h后MDA和SOD水平的變化：(a)SOD抑制率；(b)HaCaT細(xì)胞中MDA含量（與對(duì)照組比較，*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,±s,n=3）Fig.3 Changes of MDA and SOD levels in HaCaT cells after 24 h of different absorbed doses:(a)SOD inhibition rate;(b)MDAcontent of HaCaT cells(compared with the control group,*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,±s,n=3)

2.4 60Coγ射線對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

隨著吸收劑量的增加，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率升高，我們研究了60Coγ射線對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡通路的影響，與對(duì)照組相比Caspase-3蛋白酶表達(dá)增加，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因家族中Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低（圖4）。60Coγ射線對(duì)HaCaT細(xì)胞的損傷與凋亡相關(guān)。

圖4 60Coγ射線照射后24 h HaCaT細(xì)胞凋亡率及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)變化：(a)HaCaT細(xì)胞凋亡率變化；(b)HaCaT細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化（與對(duì)照組比較，*,#,&p＜0.05,**,##,&&p＜0.01,***,###,&&&p＜0.001)Fig.4 Changes of HaCaT apoptosis rate and related apoptotic proteins expression after 24 h 60Coγ-ray irradiation:(a)changes of apoptosis rate in HaCaT cells;(b)changes of HaCaT apoptosis related proteins(compared with the control group,*,#,&p＜0.05,**,##,&&p＜0.01,***,###,&&&p＜0.001)

2.5 60Coγ射線致HaCaT細(xì)胞炎癥

隨著吸收劑量的增加，造成異常的炎癥因子釋放。NLRP3炎癥小體被激活炎性因子表達(dá)增加，我們研究了60Coγ射線對(duì)HaCaT細(xì)胞NLRP3炎性通路的影響，60Coγ射線照射HaCaT細(xì)胞，使NLRP3激活Caspase-1，使IL-1β和IL-18表達(dá)增加，發(fā)生炎癥損傷（圖5）。

圖5 60Coγ射線照射后24 h HaCaT細(xì)胞炎性因子相關(guān)蛋白表達(dá)變化（與對(duì)照組比較，*，#，&p＜0.05,**，##，&&p＜0.01,***，###，&&&p＜0.001）（±s,n≥3）Fig.5 Changes of inflammatory factor related protein expression in HaCaT cells after 24 h 60Coγ-ray irradiation（compared with the control group,*，#，&p＜0.05,**，##，&&p＜0.01,***，###，&&&p＜0.001）（±s,n≥3）

3 討論

放療作為腫瘤治療中常規(guī)治療方法，在臨床上約有95%的患者會(huì)出現(xiàn)放射性皮膚損傷的不良反應(yīng)［6］，但是除了保守治療外，目前還沒(méi)有有效的預(yù)防措施或治療放射性皮膚損傷的方法［7-8］。因此，建立放射性皮膚損傷的細(xì)胞模型，在細(xì)胞分子水平探究其損傷機(jī)制具有重大意義。

急性輻射暴露后擾亂了細(xì)胞分裂和再生的正常過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡［9］，包括內(nèi)皮細(xì)胞減少和炎癥、表皮細(xì)胞的死亡［10］。氧化應(yīng)激與急性輻射暴露后的皮膚損傷關(guān)系密切，氧化應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA受損的應(yīng)激狀態(tài)，是細(xì)胞損傷和應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)的結(jié)合［11］。當(dāng)60Coγ射線照射皮膚時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，為阻止ROS的生成或中和ROS，SOD被活化，進(jìn)而對(duì)抗細(xì)胞氧化毒性，維持皮膚的氧化還原平衡［12］。隨著吸收劑量的增加，氧化還原平衡被打破，脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物MDA增加，造成皮膚的發(fā)生氧化損傷。放射性皮膚損傷的氧化損傷機(jī)制可能與60Coγ射線照射皮膚后誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，從而激活JNK及p38MAPK通路，使ERK1/2、JNK及p38MAPK轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，激活活化蛋白（AP）-1并上調(diào)環(huán)氧合酶（COX）-2基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了免疫抑制、炎癥損傷反應(yīng)，阻滯皮膚細(xì)胞增殖、分化及血管生成等過(guò)程［13］。

凋亡在維持角質(zhì)形成細(xì)胞增殖平衡中具有關(guān)鍵作用，無(wú)論是細(xì)胞分裂增殖異常，還是細(xì)胞凋亡被抑制或失控均會(huì)引起細(xì)胞動(dòng)力學(xué)改變，誘發(fā)皮膚病的產(chǎn)生［14］。60Coγ射線照射后會(huì)促使HaCaT細(xì)胞的ROS升高，使p38MAPK磷酸化的同時(shí)，又可促進(jìn)凋亡蛋白Bax及p53表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Blc-2表達(dá)下調(diào)［15］。促凋亡蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入線粒體，細(xì)胞色素C釋放，激活下游效應(yīng)器Caspase-3，使細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙，凋亡小體形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。Bcl-2家族中，Bax是促凋亡因子和Bcl-2抗凋亡因子，Bax升高，Bcl-2降低時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2可能抑制Caspase-3活化而發(fā)揮抑凋亡作用。Bcl-2家族在皮膚癌的發(fā)生中具有重要作用［17-18］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與對(duì)照組相比，照射后的HaCaT細(xì)胞中，Casepse-3表達(dá)顯著升高，Bax升高，而Bcl-2表達(dá)則降低。輻照可導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞發(fā)生凋亡，形成不可逆的程序性死亡。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)被外源性刺激激活時(shí)，會(huì)促使異常的炎性因子的釋放，引發(fā)炎性反應(yīng)［19］。外源性刺激，會(huì)激活NLRP3炎癥小體并促進(jìn)其組裝，進(jìn)一步激活可自身催化的Caspase-1，并將pro-IL-1β和pro-IL-18加工為IL-1β和IL-18，使NLRP3炎癥小體及其下游因子表達(dá)增加，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［20-21］。在照射后的HaCaT細(xì)胞中，NLRP3炎癥小體及其下游因子表達(dá)增加，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。由NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在放射性皮膚損傷中具有重要作用。

HaCaT細(xì)胞在受到吸收劑量為18 Gy的60Coγ射線照射后24 h，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生顯著改變，細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，細(xì)胞損傷顯著，適宜作為建立放射性皮膚損傷的HaCaT細(xì)胞損傷模型的條件。探究放射性皮膚損傷細(xì)胞模型中氧化、凋亡、炎癥損傷的機(jī)制，為研究放射性皮膚損傷的發(fā)生、發(fā)展及抗輻射藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。但是輻射導(dǎo)致皮膚損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，還需要進(jìn)一步探索，完善其損傷機(jī)制研究。