高 蒙 彭懷禹 王向暉 齊紅新 侯毅然 童嘉鍇 張 杰

（華東師范大學(xué)物理與電子科學(xué)學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室 上海 200241）

中國(guó)互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)信息中心（CNNIC）發(fā)布第45次《中國(guó)互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)發(fā)展?fàn)顩r統(tǒng)計(jì)報(bào)告》，報(bào)告稱截至2020年3月，我國(guó)網(wǎng)民規(guī)模達(dá)9.40億，其中使用手機(jī)上網(wǎng)的人數(shù)占比達(dá)99.30%［1］?？梢?jiàn)移動(dòng)電話在生活中越來(lái)越普及，而人們暴露于移動(dòng)電話、手機(jī)基站等產(chǎn)生的電磁輻射的時(shí)間和強(qiáng)度也隨之增加。研究表明，即使在低暴露劑量下，電磁輻射也能產(chǎn)生一些生物效應(yīng)［2-4］。由于人類大腦在青春期早期就可以達(dá)到最大腦容量［5-6］，而處于青春期的大腦部分重要區(qū)域（海馬、杏仁核、前額葉等）對(duì)電磁輻射更加敏感［7］，因此人們對(duì)長(zhǎng)期暴露于低劑量電磁場(chǎng)環(huán)境中的青少年大腦發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶能力是否會(huì)受到影響產(chǎn)生了擔(dān)憂。為此，學(xué)者們?cè)趧?dòng)物水平開(kāi)展了一系列電磁輻射對(duì)大腦神經(jīng)系統(tǒng)及學(xué)習(xí)記憶能力影響的研究。研究表明，連續(xù)15 d低場(chǎng)強(qiáng)射頻輻射（功率密度1 500μW/cm2，2 h/d）可導(dǎo)致幼年大鼠聯(lián)合型學(xué)習(xí)記憶能力下降，引起前額葉內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂［8］。2 000μW/cm2電磁輻射可以降低大鼠海馬組織NR1蛋白及其mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降［9］。2.45 GHz微波輻射大鼠28 d（1 h/d）和計(jì)算機(jī)顯示器的陰極射線管輻照小鼠（電場(chǎng)強(qiáng)度0.9 V/m，功率密度0.22μW/cm2，18 h/d），結(jié)果都顯示長(zhǎng)時(shí)間電磁輻射會(huì)擾亂生物體海馬組織膽堿能系統(tǒng)，并對(duì)其相關(guān)標(biāo)志物水平產(chǎn)生影響［10-11］。這些研究為電磁輻射的安全標(biāo)準(zhǔn)制定和防護(hù)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，這些實(shí)驗(yàn)多是對(duì)固定體位的動(dòng)物進(jìn)行單頻周期重復(fù)性地輻照，與自由體位、復(fù)雜組合暴露環(huán)境以及全天不間斷暴露的實(shí)際情況有一定的差異。

為能夠更加真實(shí)地模擬實(shí)際生活中的電磁環(huán)境，我們構(gòu)建了一個(gè)能夠長(zhǎng)期全天候不間斷輻照且大鼠能在鼠籠中自由活動(dòng)的輻照平臺(tái)，用于研究白天8 h工作時(shí)間處于職業(yè)暴露狀態(tài)，其余16 h處于公眾暴露狀態(tài)條件下，長(zhǎng)期暴露對(duì)發(fā)育期SD大鼠大腦組織及認(rèn)知能力的影響，以期為環(huán)境暴露安全標(biāo)準(zhǔn)的制定提供更全面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

乙酰膽堿（Ach）、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、膽堿酯酶（AChE）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（BDNF）化學(xué)試劑盒、二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色液購(gòu)自南昌雨露實(shí)驗(yàn)有限公司。

Labsystems Finnpipette 100μL單道移液器；Thermo 50μL 8道移液器；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；DG5033A酶標(biāo)儀（南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司）；RM2015石蠟切片機(jī)（Leica，德國(guó)）；DMi8光學(xué)顯微鏡（Leica，德國(guó)）。

1.2 輻照裝置與動(dòng)物分組

輻照裝置：微波暗室（上海雅馳實(shí)業(yè)有限公司），4 m×2.5 m×2.5 m，被分隔成兩間，一間作為輻照室，另一間作為假輻照室；1.8 GHz微波發(fā)射源，功率可調(diào)，可通過(guò)Wifi無(wú)線網(wǎng)進(jìn)行劑量的遠(yuǎn)程控制，以確保大鼠在整個(gè)輻照期間不受打擾且電磁暴露劑量（SAR，W/kg）維持恒定。

雄性SD大鼠（3周齡）由華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)經(jīng)華東師范大學(xué)動(dòng)物倫理中心批準(zhǔn)進(jìn)行（倫理審查編號(hào)：R20141002）。在接受輻照前進(jìn)行一周的適應(yīng)實(shí)驗(yàn)，保證動(dòng)物能夠適應(yīng)環(huán)境。然后將108只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Control，n=36）、假輻照組（Sham，n=36）和輻照組（EMF，n=36）。其中，Control組飼養(yǎng)于輻照暗室外的房間內(nèi)，EMF組、Sham組分別飼養(yǎng)于上述暗室的兩間內(nèi)，且保證均處于受控的環(huán)境中（溫度（25±2）℃，濕度（50±5）%，模擬晝夜情況，9：00-21：00開(kāi)燈，其余時(shí)間處于黑暗狀態(tài)）。EMF組每天9：00-17：00暴露于職業(yè)接觸限值（0.40 W/kg）的電磁輻射，其余時(shí)間暴露于公眾接觸限值0.08 W/kg（國(guó)際非電離輻射防護(hù)委員會(huì)針對(duì)熱效應(yīng)制定的的安全標(biāo)準(zhǔn)（ICNRP，2010））［12］。整個(gè)輻照過(guò)程持續(xù)4周，每隔3 d對(duì)大鼠進(jìn)行一次體重稱量（為調(diào)整入射功率提供數(shù)據(jù)），并檢查其健康情況和設(shè)備的工作情況。考慮大鼠體重變化會(huì)顯著影響其對(duì)電磁能量的吸收，為確保全身平均SAR值穩(wěn)定在0.40 W/kg和0.08 W/kg，微波源發(fā)射功率也需隨之進(jìn)行不斷地調(diào)整。

1.3 樣品制備及測(cè)試方法

1.3.1樣品制備

取樣時(shí)間為輻照結(jié)束后次日9點(diǎn)，SD大鼠根據(jù)體重給予相應(yīng)劑量的戊巴比妥鈉進(jìn)行深度麻醉，處死，斷頭取腦。在冰上迅速分離海馬組織，一部分按質(zhì)量（g）?體積（mL）=1?9加入4℃生理鹽水，用于后續(xù)生化指標(biāo)的檢測(cè)；另一部分用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，用于后續(xù)組織切片觀察。

1.3.2海馬膽堿能標(biāo)志物水平檢測(cè)

使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)SD大鼠海馬組織中的總蛋白濃度。嚴(yán)格按照南京建成生物有限公司試劑盒ACh、ChAT、AChE的操作方法進(jìn)行檢測(cè)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各管吸光度值，利用蒸餾水調(diào)零。

1.3.3海馬組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、氧化應(yīng)激指標(biāo)水平檢測(cè)

使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)SD大鼠海馬組織中的總蛋白濃度。嚴(yán)格按照南京建成生物有限公司試劑盒DA、NE、5-HT、BDNF和SOD、MDA的操作方法進(jìn)行檢測(cè)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各管吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出結(jié)果。

1.3.4海馬組織形態(tài)學(xué)觀察

4%多聚甲醛溶液固定后的海馬組織經(jīng)脫水、石蠟包埋切片（5μm）后，再進(jìn)行HE染色，最后在顯微鏡下觀察大鼠海馬組織形態(tài)。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

輻照結(jié)束后立即進(jìn)行為期一周的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，用于評(píng)估電磁暴露對(duì)SD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響［13-14］。將大鼠頭朝下，緊貼池壁輕放入水中，隨機(jī)選取放入位置，可以取0°、90°、180°、360°的角為起始位置，開(kāi)始60 s的引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，如果大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)則引導(dǎo)大鼠到達(dá)平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留20 s。每只每天訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練時(shí)間間隔為15～20 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。訓(xùn)練結(jié)束后2 d撤除平臺(tái)，將動(dòng)物由原先的4個(gè)位置放入水中，記錄動(dòng)物在水中的活動(dòng)軌跡、進(jìn)入平臺(tái)位置所花的時(shí)間及撤掉平臺(tái)后大鼠進(jìn)入平臺(tái)范圍內(nèi)的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS statistics 23軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以±s形式表示，p＜0.05視為具有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于Control組與Sham組無(wú)顯著性差異，所以有關(guān)結(jié)果均對(duì)Sham組進(jìn)行歸一。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，與Sham組進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)水平變化及組織形態(tài)觀察

圖1（a）是SD大鼠腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD活性的檢測(cè)結(jié)果，圖1（b）是氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA含量的檢測(cè)結(jié)果。從圖1可以看出，輻照后0 d大鼠海馬組織內(nèi)的SOD活性和MDA含量在輻照后無(wú)顯著性變化，SOD是自由基清除酶，MDA是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，這說(shuō)明體內(nèi)無(wú)多余氧自由基形成，未產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖1 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)(n=6)：(a)大鼠海馬的SOD活性(p＜0.05)；（b）大鼠海馬的MDA含量Fig.1 Oxidative stress-related indicators(n=6):(a)SOD activity in rats'hippocampus(p＜0.05);(b)Content of MDA in rats'hippocampus

圖2為HE染色的大鼠海馬組織。由圖2可以觀察到，Control組、Sham組與EMF組海馬組織形態(tài)均正常，EMF組DG區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)排列緊密，顆粒細(xì)胞呈圓形或卵圓形，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，CA1區(qū)的錐體細(xì)胞均為3～4層，且排列整齊致密，胞核飽滿，邊界清晰，較對(duì)照無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，本輻照條件下，大鼠的海馬組織形態(tài)未受到損傷，且未產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖2 HE染色的大鼠海馬組織(40×)：(a)Control組的CA1區(qū)；(b)Sham組的CA1區(qū)；(c)EMF組CA1區(qū)；(d)Control組的DG區(qū)；(e)Sham組的DG區(qū)；(f)EMF組的DG區(qū)Fig.2 Rats'hippocampal tissue at HE stained(40×):(a)CA1 in Control group;(b)CA1 in Sham group;(c)CA1 in EMF group;(d)DG in Control group;(e)DG in Sham group;(f)DG in EMF group

2.2 輻照后大鼠海馬膽堿能、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)志物水平的變化

圖3是輻照后0 d、7 d、14 d SD大鼠腦組織中海馬膽堿能標(biāo)志物Ach含量、AChE活性和ChAT活性的檢測(cè)結(jié)果。

圖3 0 d、7 d、14 d大鼠海馬組織內(nèi)Ach、AChE和ChAT相對(duì)水平變化；*p＜0.05，與Sham組比較；n=6Fig.3 Changes in the relative levels of Ach,AChE,and ChAT in the hippocampus of rats at 0 d,7 d,and 14 d;*p＜0.05,compared with the Sham group;n=6

Ach由膽堿在ChAT的催化作用下合成，最后被AChE水解成膽堿和醋酸，ChAT和AChE共同維持著Ach的動(dòng)態(tài)平衡，它的含量與大腦記憶能力強(qiáng)弱有關(guān)。如圖3所示，輻照結(jié)束后，Ach含量與ChAT活性較Sham組顯著性上升，有一定的上調(diào)趨勢(shì)，與Sham組相比，具有顯著性差異；而AChE活性與Sham組相比，則顯著性下降。第7天與第0天相似，在第14天Ach含量、ChAT活性和AChE活性基本恢復(fù)，這說(shuō)明低劑量長(zhǎng)期輻射會(huì)引起膽堿能系統(tǒng)紊亂，但這種損傷是可恢復(fù)的。

圖4是輻照后0 d、7 d、14 d SD大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE、5-HT以及營(yíng)養(yǎng)因子BDNF含量的檢測(cè)結(jié)果。5-HT對(duì)大腦發(fā)育以及情緒調(diào)節(jié)至關(guān)重要，輻照后，大鼠的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT與DA含量呈顯著性升高趨勢(shì)，這會(huì)影響大鼠認(rèn)知靈活性。NE與BDNF在輻照后與Sham組相比無(wú)顯著性差異。BDNF在神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育和修復(fù)損傷過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，在輻照后第7天，BDNF含量與第0天相比有一定的升高，這說(shuō)明在第7天，神經(jīng)遞質(zhì)水平可能進(jìn)入恢復(fù)狀態(tài)。DA與BDNF含量與Sham組相比具有顯著性差異，5-HT與NE無(wú)顯著性變化。在輻照后14 d，各神經(jīng)遞質(zhì)含量與Sham組相比無(wú)顯著性差異，說(shuō)明該輻照條件對(duì)生物體造成的損傷并非是永久性的，神經(jīng)遞質(zhì)水平都基本恢復(fù)正常。

圖4 0 d、7 d、14 d大鼠海馬組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平；*p＜0.05，與Sham組比較；n=6Fig.4 Neurotransmitter levels in hippocampus of rats at 0 d,7 d,and 14 d;*p＜0.05,compared with the Sham group;n=6

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

圖5是訓(xùn)練期大鼠的逃避潛伏期時(shí)長(zhǎng)隨訓(xùn)練天數(shù)的變化情況，逃避潛伏期時(shí)長(zhǎng)與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)。如圖5，Control組、Sham組和EMF組大鼠的逃避潛伏期時(shí)長(zhǎng)均隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而減小，在照后2 d、3 d、4 d EMF組的逃避潛伏期時(shí)長(zhǎng)雖然有略高于其余兩組的趨勢(shì)，但在多次訓(xùn)練后EMF組的訓(xùn)練結(jié)果與其余兩組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)條件下，長(zhǎng)期低劑量電磁輻射未對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生顯著性影響。

圖5 每天訓(xùn)練4次的大鼠潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)的變化情況(n=18)Fig.5 Changes of incubation period with training days in rats trained four times a day(n=18)

在訓(xùn)練階段結(jié)束后撤去水下平臺(tái)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、在原平臺(tái)所在象限（目標(biāo)象限）停留的時(shí)間（持續(xù)時(shí)間）、航行路程占比（目標(biāo)象限路程/總路程），其結(jié)果如表1所示。EMF組的各項(xiàng)指標(biāo)與Sham組、Control組相比均無(wú)顯著性差異。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)條件未對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生顯著性影響。

表1 大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)試結(jié)果Table 1 Results of spatial learning and memory ability in rats during examination stage (n=18)

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，射頻電磁輻射主要通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損害［15］，在正常的代謝過(guò)程中，體內(nèi)會(huì)不斷地產(chǎn)生自由基，因此也會(huì)存在自由基清除酶，使之達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。SOD是一種自由基清除酶，而MDA是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，本研究中SD大鼠海馬組織內(nèi)的SOD活性與MDA含量輻照前后無(wú)顯著性差異，這揭示了1.8 GHz組合電磁輻射對(duì)SD大鼠未造成顯著的氧化應(yīng)激損傷。與之相應(yīng)地，也沒(méi)有觀察到大鼠海馬組織形態(tài)的異常，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)輻照條件下，大鼠腦部海馬組織沒(méi)有受到損傷。

學(xué)習(xí)和記憶是腦的高級(jí)功能，海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，含有豐富的膽堿能纖維［16］，也是容易受到電磁輻射影響的區(qū)域。腦中重要的膽堿能標(biāo)志物主要包括Ach、AChE和ChAT，這與大腦的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力密不可分。其中Ach與腦功能最為密切，Ach由膽堿在ChAT的催化作用下合成，通過(guò)乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸囊泡，從突觸囊泡釋放后被AChE水解成膽堿和醋酸，ChAT和AChE共同維持著Ach的動(dòng)態(tài)平衡，從而確保膽堿能系統(tǒng)的穩(wěn)定。本輻照條件會(huì)引起海馬中Ach含量的增加，AChE活性降低和ChAT活性增強(qiáng)，說(shuō)明長(zhǎng)期低劑量電磁輻射會(huì)引起膽堿能系統(tǒng)紊亂。這與Obajuluwa等［17］的研究結(jié)果（2.5 GHz射頻輻射使整個(gè)大腦的AChE活性降低，而突觸內(nèi)的Ach含量增加）相似。

對(duì)大腦認(rèn)知能力發(fā)揮重要作用的還包括一些單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，譬如NE、DA、5-HT等。DA在控制機(jī)體行為運(yùn)動(dòng)、情緒以及感知方面是必要的，5-HT系統(tǒng)在大腦發(fā)育、學(xué)習(xí)認(rèn)知以及情緒調(diào)節(jié)中至關(guān)重要，它可以抑制學(xué)習(xí)記憶能力，其含量的升高可以損害認(rèn)知靈活性［18］。有研究報(bào)道，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE與5-HT可以和膽堿能系統(tǒng)產(chǎn)生交互作用［19］，學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程非常復(fù)雜，是由各類神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)系統(tǒng)共同合作完成。本研究觀察到在輻照結(jié)束后0 d神經(jīng)遞質(zhì)DA和5-HT含量升高，這與趙曉琳等［20］發(fā)現(xiàn)的918 MHz、1 mW/cm2的微波輻射（45 d（1 h/d））會(huì)引起DA、NE和5-HT水平升高的結(jié)果相類似。而流行病學(xué)調(diào)查中指出的使用移動(dòng)設(shè)備通話1 h以上，會(huì)出現(xiàn)眩暈、煩悶、注意力不集中、記憶力下降、疲勞、頭疼等不適癥狀［21］，也暗示了長(zhǎng)期電磁輻射會(huì)引起體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平的紊亂。在本實(shí)驗(yàn)條件下這種紊亂現(xiàn)象只是暫時(shí)的，可隨照后時(shí)間的延長(zhǎng)自行恢復(fù)。而且，這一紊亂也并不足以引起大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的明顯下降。

本研究的實(shí)驗(yàn)條件更加真實(shí)地模擬現(xiàn)實(shí)生活中的人們所處的電磁環(huán)境，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在安全限制標(biāo)準(zhǔn)下，長(zhǎng)期低劑量電磁輻射對(duì)生物體也會(huì)有一定的影響，但在14 d后會(huì)恢復(fù)至正常水平，這也為電磁暴露劑量的安全限值標(biāo)準(zhǔn)的完善提供數(shù)據(jù)支持。