倪茂君 王靜霞 張曉彬 彭朝榮,2

1（四川省原子能研究院 成都 610101）

2（輻照保藏四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都 610101）

黃芪是中國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，素有“十藥九芪”之稱(chēng)，應(yīng)用十分廣泛。黃芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）作為黃芪主要有效成分之一，含量高達(dá)10%，主要包含葡聚糖、中性及酸性雜多糖等成分，糖苷鍵類(lèi)型以α型為主，β型較少，具有免疫調(diào)節(jié)、雙向血糖調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗菌及抗病毒等藥理作用［1-2］。近年來(lái)，低分子量多糖的生物活性受到越來(lái)越多的關(guān)注。李紅法等［3］和劉雅欣等［4］通過(guò)分級(jí)醇沉方法獲得不同分子量黃芪多糖，對(duì)其結(jié)構(gòu)組成與生物活性研究發(fā)現(xiàn)，低分子量黃芪多糖具有較高的生物活性。王瑞曇［5］研究發(fā)現(xiàn)黃芪粗多糖的腸代謝物具有抗S180小鼠肉瘤作用，大分子量的黃芪多糖酸水解產(chǎn)物——小分子量多糖具有增強(qiáng)免疫功能的作用，而高分子多糖類(lèi)化合物在腸內(nèi)不易被直接吸收，因此提出“中藥多糖是前藥”這一假設(shè)。

此外，不少研究者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)降解天然大分子多糖，可以獲得具有更高生物活性的多糖成分，降解方法亦主要采用微波法［6，8］、超聲波法［9，11-13］及氧化法［7，10，14］等自由基降解反應(yīng)中的一種或兩種復(fù)合，以提高降解速率和降解產(chǎn)物收率。輻照降解是一種利用高能射線作用于物質(zhì)，通過(guò)引發(fā)康普頓效應(yīng)、電子對(duì)效應(yīng)及自由基等物理化學(xué)效應(yīng)而對(duì)物質(zhì)產(chǎn)生降解作用的方法。已有研究表明，通過(guò)輻照技術(shù)可以有效降解天然多糖，提高多糖生物活性［15?18］，具有操作簡(jiǎn)單、降解效率高等優(yōu)勢(shì)。本研究采用60Coγ射線輻照處理黃芪多糖，重點(diǎn)對(duì)15%和30%醇沉所得黃芪大分子多糖部位的輻照降解分子量、抗氧化活性及多糖結(jié)構(gòu)組成變化進(jìn)行研究和闡述，以期實(shí)現(xiàn)大分子黃芪多糖的有效降解，提高黃芪多糖的生物利用度。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黃芪：產(chǎn)地甘肅省，北京同仁堂健康藥業(yè)（福州）有限公司；三氯乙酸、正丁醇、三氟乙酸：分析純（AR），成都市科龍化工試劑廠；無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇：AR，成都市科龍化工試劑廠；乙腈：優(yōu)級(jí)純（GR），成都市科龍化工試劑廠；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：AR，成都市科隆化學(xué)品有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品：純度99%，上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：AR，美 國(guó)Sigma公司；超純水：18.25 MΩ·cm，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 黃芪多糖的制備

取100 g黃芪片粉碎后過(guò)孔徑0.425 mm篩，加入500 mL 95%乙醇回流提取2 h，過(guò)濾脫去色素及小分子物質(zhì)，相同條件再提取1次，濾渣于50℃揮干乙醇備用。將脫脂處理后的黃芪粉末分別按10∶1（mL/g）和8∶1（mL/g）水料比，于90℃回流提取兩次，每次2 h，過(guò)濾合并濾液，濃縮至400～500 mL，按體積比1∶1加入5%三氯乙酸-正丁醇溶液，快速攪拌1 min，靜置1 h后離心收集多糖溶液，將多糖溶液繼續(xù)濃縮至200 mL，加入無(wú)水乙醇調(diào)醇濃度為80%，收集沉淀，冷凍干燥得黃芪粗多糖。將粗多糖復(fù)溶至200 mL，離心除去不容物，加入乙醇，調(diào)醇濃度為15%，收集沉淀，冷凍干燥得白色APS 1；剩余溶液繼續(xù)加入乙醇，調(diào)醇濃度為30%，收集沉淀，冷凍干燥得淡黃色APS 2。

1.3 輻照降解

將APS 1和APS 2分別配置成不同濃度溶液裝入安倍瓶，封口后采用60Coγ射線輻照不同劑量，輻照后多糖溶液濃縮至1/4體積，5倍乙醇量沉淀降解多糖，除去小分子降解產(chǎn)物后冷凍干燥備用，降解多糖得率（變量記為R）按式（1）計(jì)算。輻照源：四川省原子能研究院（29.6×1015Bq）60Co源，動(dòng)態(tài)輻照；吸收劑量采用硫酸亞鐵化學(xué)劑量計(jì)標(biāo)定。

式中：Wt為不同輻照降解條件下沉淀所得多糖含量；W0為輻照前多糖含量。

1.4 黃芪多糖分子量測(cè)定

采用凝膠滲透色譜（Gel permeation chromatography，GPC）法［10］測(cè)定分子量。將窄分布的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（2 500～5 348 000）和待測(cè)樣品配成5 mg/mL流動(dòng)相溶液，經(jīng)0.45μm濾膜后進(jìn)樣檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)分子量校正曲線，由GPC軟件計(jì)算樣品分子量。檢測(cè)條件：Waters 515液相色譜儀，檢測(cè)器為Waters 2410示差檢測(cè)器；色譜柱為Waters Ultrahyrdogel Linear凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相為0.2 mol/L硫酸鈉（Na2SO4），流速0.60 mL/min；色譜柱柱溫為40℃，進(jìn)樣體積20μL。

1.5 DPPH自由基清除能力

參照張宇［19］的方法測(cè)試樣品的DPPH清除能力。取2 mL一定濃度的黃芪多糖溶液加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH-甲醇溶液，以2 mL DPPH溶液和2 mL雙蒸水為底物對(duì)照樣，混合均勻后避光于37℃反應(yīng)30 min，在517 nm處檢測(cè)吸光度A值。DPPH抑制率（變量記為I）按式（2）計(jì)算。

式中：Ac為2 mL DPPH溶液和2 mL雙蒸水溶液的吸光度；Ai為2 mL多糖樣品加2 mL DPPH溶液的吸光度值。

1.6 單糖組成分析

采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC），1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生［19］分析黃芪多糖單糖組成。取單糖對(duì)照品（甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA））用雙蒸水配置成物質(zhì)的量濃度為40 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液，經(jīng)PMP衍生，將水相稀釋成5種不同濃度，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC進(jìn)樣分析，以物質(zhì)的量濃度對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，制作回歸方程。稱(chēng)取黃芪多糖樣品5 mg經(jīng)2 mol/L三氟乙酸（TFA）水解后進(jìn)行PMP衍生，水相用0.45μm濾膜過(guò)濾后供高效液相色譜進(jìn)樣分析，根據(jù)回歸方程計(jì)算各單糖含量。檢測(cè)條件：色譜柱為Megres C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相A為0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH=6.8）；流動(dòng)相B為乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10μL，進(jìn)行梯度洗脫。

1.7 紅外光譜檢測(cè)

將降解前后多糖樣品在真空干燥箱中低溫干燥，分別取5～10 mg樣品粉末，采用KBr壓片，在4 000～500 cm?1進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收劑量對(duì)黃芪多糖分子量和得率的影響

圖1為在1 mg/mL濃度下，不同吸收劑量對(duì)兩種黃芪多糖分子量及其得率的影響。

圖1 吸收劑量對(duì)APS分子量及其得率的影響：(a)APS 1；(b)APS 2Fig.1 Effects of absorbed doseon molecular weight and yield of APS:(a)APS 1;(b)APS 2

從圖1看出，兩種多糖降解趨勢(shì)相似，隨著吸收劑量的增大，多糖分子量在5 kGy下迅速降低而后趨于穩(wěn)定。APS 1分子量從1.93×106降解至2.33×104，多糖回收得率隨著吸收劑量的增大逐漸降低至44.7%；APS 2分子量從3.92×105快速降低至2.54×104，多糖得率同樣隨著吸收劑量的增大逐漸降低至39.2%。在水溶液的輻照降解中，γ射線除直接作用于大分子引發(fā)降解外，還可激發(fā)水分子形成高氧化性的·OH、·H等自由基，與周?chē)挠袡C(jī)大分子RH相互作用，奪取大分子上的氫而促進(jìn)大分子的降解。當(dāng)多糖分子量相對(duì)較大時(shí)，分子鏈中暴露的活性位點(diǎn)較多［20］；而當(dāng)分子量相對(duì)較小時(shí)，糖鏈縮短，暴露的活性位點(diǎn)少，分子量變化幅度小，同時(shí)分子量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致弛豫時(shí)間縮短，不利于繼續(xù)降解［21］。在濃度1 mg/mL下，輻照對(duì)兩種黃芪多糖均有較高的降解速率，但過(guò)高的降解速率導(dǎo)致多糖的過(guò)度降解，所得黃芪多糖的回收得率較低，應(yīng)綜合考慮多糖降解分子量及其得率，優(yōu)選降解條件。

2.2 多糖濃度對(duì)黃芪多糖分子量與得率的影響

為有效實(shí)現(xiàn)多糖的逐步降解和高回收得率，在1 kGy低劑量下考察了不同溶液濃度下其分子量與得率的變化，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在1 kGy低劑量輻照下，兩種多糖均隨著濃度降低分子量逐步降低，呈現(xiàn)梯度趨勢(shì)，多糖回收得率均在85%以上，回收率較高。APS 1與未輻照樣（Control）相比（a），其分子量逐漸降低至8.28×105，多糖回收率保持在85%以上。APS 2與未輻照樣（Control）相比（b），分子量逐漸降低至1.95×105，回收率保持在88%以上。這是由于在相同劑量下，多糖濃度過(guò)高時(shí)，多糖高分子間易形成膠團(tuán)且分子排列緊密，分子鏈不易斷裂，從而影響降解效果［9］。表明該條件下輻照降解過(guò)程是以激發(fā)水分子產(chǎn)生自由基引起的降解為主，因此可以通過(guò)調(diào)整多糖濃度即含水量實(shí)現(xiàn)多糖在低劑量下的降解速率調(diào)控。但濃度過(guò)低，多糖降解增大，回收率亦逐漸降低。

圖2 多糖濃度對(duì)APS分子量及其得率的影響：(a)APS 1；(b)APS 2Fig.2 Effects of polysaccharide concentration on molecular weight and yield of APS:(a)APS 1;(b)APS 2

2.3 單糖組成分析

本研究選擇8種單糖（Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara）作為黃芪多糖的單糖組成分析標(biāo)準(zhǔn)?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)單糖經(jīng)PMP柱前衍生的HPLC分析結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)8種單糖的保留時(shí)間，對(duì)其進(jìn)行單糖標(biāo)準(zhǔn)品定性驗(yàn)證。8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品在254 nm波長(zhǎng)處的現(xiàn)行回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。該方法可有效分離8種單糖，且各單糖在該濃度范圍內(nèi)具有較高的線性關(guān)系。

表1 不同單糖的線性方程Table 1 Linearity of different carbohydrates

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖液相色譜峰Fig.3 Liquid chromatographic peaks of mixed standard monosaccharide

表2所示為不同降解條件下兩種多糖的單糖組成與物質(zhì)的量比。從表2結(jié)合紅外光譜法分析可知，APS 1為α型葡聚糖，并含有少量的Man、GalA、Gal、Xyl和Ara，各單糖物質(zhì)的量比為0.24∶0.19∶22.07∶0.36∶0.08∶0.51。隨著分子量降低，Man、Glc物質(zhì)的量含量逐漸降低，其余單糖幾乎降解完全。這可能是由于分子量降低在酸解過(guò)程中Glc易被氧化使得副反應(yīng)增大有關(guān)。APS 2為酸性雜多糖，主要含有Man、Rha、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara，各單糖物質(zhì)的量比為0.37∶0.13∶2.89∶0.38∶0.52∶0.10∶1.22。輻照降解后，隨著分子量減小，Xyl完全降解；Glc含量則先減小，后增大；其余各單糖物質(zhì)的量含量則隨著分子量減小呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)分子量為8.25×104時(shí)，各單糖物質(zhì)的量含量較高。

表2 輻照降解對(duì)黃芪多糖單糖組成的影響Table 2 Effect sof irradiation degradation on monosaccharide composition of Astragaluspolysaccharide

APS 1與APS 2輻照降解后單糖組成與物質(zhì)的量比的變化可能是由于體系中不同糖苷鍵類(lèi)型、單糖本身在支鏈和主鏈分布不均［9］以及糖苷鍵斷裂致使端基異構(gòu)化等因素造成的。Gomez等［22］的研究發(fā)現(xiàn)，降解導(dǎo)致糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，表明其可能變化成內(nèi)酯，與抗氧化活性變化有關(guān)。此外，APS 2純度較APS 1低，在輻照降解過(guò)程中可能因雜質(zhì)降解而使降解后APS 2純度提高，各單糖物質(zhì)的量含量增大，有利于多糖的純化和生物活性提高。

2.4 降解黃芪多糖紅外光譜分析

圖4為APS 1及APS 2在質(zhì)量濃度為1 mg/mL條件下未經(jīng)處理的輻照凍干樣品紅外光譜圖。從圖4可以看出，APS 1在3 431 cm?1處為羥基伸縮振動(dòng)，2 930 cm?1處為C?H鍵伸縮振動(dòng)，1 645 cm?1處為羥基彎曲振動(dòng)，1 425 cm?1處為?CH2和CH3基團(tuán)，1 154 cm?1處為糖環(huán)上C?O?C伸縮振動(dòng)，1 080 cm?1和1 024 cm?1為醇羥基變角吸收峰，930 cm?1弱峰為端基碳C?H彎曲振動(dòng)峰，846 cm?1為α-型糖苷鍵，700～500 cm?1為環(huán)呼吸峰等。表明APS 1是α-吡喃型糖鏈結(jié)構(gòu)，與單糖組成結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。經(jīng)不同劑量輻照后，APS 1從5 kGy開(kāi)始在1 726 cm?1出現(xiàn)吸收峰，并隨著吸收劑量的增大而逐漸增大，930 cm?1和846 cm?1處逐漸減小消失。1 154 cm?1、1 080 cm?1和1 024 cm?1合并為一個(gè)峰，表明降解體系中糖苷鍵斷裂，糖含量減少，有大量羰基和C?O結(jié)構(gòu)的小分子化合物生成。

圖4 APS及輻照降解多糖紅外光譜分析：(a)APS 1；(b)APS 2Fig.4 FTIR-spectra analysis of APS and irradiation degradated APS:(a)APS 1;(b)APS 2

APS 2紅外光譜中除多糖特征峰（3 436 cm?1、2 930 cm?1、1 632 cm?1、1 425cm?1、1 147 cm?1、1 103 cm?1、1 020 cm?1）外，在1 745 cm?1處有糖醛酸羰基特征峰，在1 238 cm?1處有硫酸酯S=O鍵特征峰，920 cm?1、887 cm?1和828 cm?1有微弱的特征峰，表明APS 2中可能含有α-糖苷鍵、β-糖苷鍵，如圖3所示。APS 2為含糖醛酸的雜多糖，糖純度較低導(dǎo)致其指紋圖譜區(qū)特征峰不明顯。隨著吸收劑量增加，1 745 cm?1處特征峰逐漸增大，1 147～1 020 cm?1特征峰逐漸消失，合并到1 100 cm?1形成寬峰，900～700 cm?1指紋區(qū)特征峰基本消失，表明高劑量下小分子糖單元結(jié)構(gòu)破壞，生成含C?O、C=O結(jié)構(gòu)的小分子化合物，與APS 1結(jié)果一致。

不同輻照條件下APS 1及APS 2中羰基峰面積（1 726～1 745 cm?1）與羥基峰（1 632～1 645 cm?1）面積比列于表3。如表3顯示，APS 1在5 kGy出現(xiàn)羰基峰，其峰面積比隨著劑量而增大；APS 2中羰基峰面積比值在5 kGy下變化不大，而后逐漸增大，但其變化值較APS 1小。該羰基峰可能是由降解小分子多糖繼續(xù)反應(yīng)生成，與圖1中分子量變化與回收得率結(jié)果相一致。武小芬等［17］通過(guò)研究木聚糖干粉輻照發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吸收劑量達(dá)到200 kGy以上時(shí)，木聚糖糖苷鍵斷裂生成低分子糖，當(dāng)劑量達(dá)到400～1 200 kGy，降解的小分子單糖在輻照作用下，進(jìn)一步發(fā)生氧化、降解、異構(gòu)和重排等反應(yīng)，生成小分子醛、酮、酸類(lèi)化合物及分子內(nèi)脫水閉環(huán)、氧化等生成呋喃類(lèi)化合物。本文所述黃芪多糖的輻照反應(yīng)在水溶液中進(jìn)行，如上所述，當(dāng)吸收劑量達(dá)到5 kGy時(shí)，多糖分子量迅速降低至105以下，溶液中高氧化性自由基與小分子多糖反應(yīng)，從而釋放出羰基，經(jīng)過(guò)分子重排、反應(yīng)可能生成醛酮類(lèi)化合物、糠醛化合物及不飽和糖基化合物等。APS 2中糖醛酸及雜多糖的存在可能導(dǎo)致其降解產(chǎn)物與APS 1的差異。

表3 不同吸收劑量下羰基峰面積與羥基峰面積比Table 3 Peak area ratio of carbonyl and hydroxyl group under different absorbed doses

輻照降解體系回收所得產(chǎn)物的紅外光譜如圖5所示。由圖5可知，APS 1中回收所得降解多糖與降解混合體系相比，1 726 cm?1處特征峰消失，而930 cm?1和846 cm?1處特征峰增強(qiáng)，與未輻照樣紅外特征峰一致；APS 2輻照降解前后紅外特征峰的結(jié)果一致。這一結(jié)果表明，通過(guò)輻照降解黃芪多糖，多糖以糖苷鍵斷裂為主，分子量逐步降低，分子結(jié)構(gòu)及活性基團(tuán)無(wú)明顯改變；采用醇沉回收可以有效去除小分子降解產(chǎn)物，回收方法可行。

圖5 輻照降解前后黃芪多糖紅外光譜分析：(a)APS 1；(b)APS 2Fig.5 FTIR-spectra analysis of APS before and after irradiation:(a)APS 1;(b)APS 2

2.5 黃芪多糖的抗氧化活性

輻照降解條件下黃芪多糖對(duì)DPPH的抑制率結(jié)果如圖6所示。APS 1對(duì)DPPH的抑制率隨著分子量的降低從3.55%增大到20.53%，在分子量為23.3×104時(shí)具有最大值，隨著分子量進(jìn)一步降低抑制率下降。APS 2對(duì)DPPH的抑制率隨著分子量降低從15.23%增大到29.61%，在分子量為8.25×104時(shí)具有最大值，隨著分子量進(jìn)一步降低抑制率同樣下降。從自由基抑制結(jié)果可以看出，分離所得兩種大分子多糖的抗氧化活性差異較大，APS 2抗氧化活性顯著高于APS 1，這是由于兩種多糖分子量及多糖結(jié)構(gòu)組成造成的［3-5］，在降解過(guò)程中APS 2對(duì)DPPH抑制率的提高率并未顯著高于APS 1。

圖6 APS 1(a)、APS 2(b)對(duì)DPPH的抑制活性Fig.6 Inhibitory activity of APS 1(a)and APS 2(b)on DPPH

已有相關(guān)研究表明，通過(guò)降解提高多糖抗氧化活性的可能原因是：具有更好水溶性，活性部位與自由基接觸面積變大［11］；分子柔韌性改變［11］；空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子間作用力及氫鍵作用力減弱［14］；更多羥基與自由基直接反應(yīng)增強(qiáng)［13］；供氫能力增強(qiáng)，通過(guò)提供氫與自由基形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)［10］等。APS 1分子量較大，溶解性和均一性較差，通過(guò)輻照降解后分子量迅速降低，有利于提高APS 1的水溶性，實(shí)現(xiàn)上述各因素的轉(zhuǎn)變，因此其抗氧化活性提高較明顯。APS 2為黃芪多糖主要活性成分，降解過(guò)程中可能導(dǎo)致其活性基團(tuán)如糖醛酸含量的降低而使其活性降低。王凌等［23］相關(guān)研究表明，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高抗氧化活性越好。但多糖生物活性是多種因素的綜合效應(yīng)，因此其他因素包括化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)、側(cè)鏈等的不同可能導(dǎo)致其活性的不同。

3 結(jié)論

初步分析了不同分子量和結(jié)構(gòu)組成的黃芪多糖的輻照降解及其抗氧化性的相關(guān)性。結(jié)果表明：在5 kGy以下輻照即可顯著降低多糖分子量，通過(guò)濃度控制可以在低劑量輻照降解黃芪多糖，回收得率高，多糖基本結(jié)構(gòu)組成和活性基團(tuán)無(wú)顯著變化。降解多糖在一定范圍內(nèi)分子量與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)，在較低分子量下其抗氧化活性降低。因此，可通過(guò)低劑量輻照實(shí)現(xiàn)大分子多糖的適度降解，提高大分子多糖生物活性，但輻照降解對(duì)多糖空間結(jié)構(gòu)造成的改變還有待進(jìn)一步研究。此外，APS 1主要成分為大分子葡聚糖，在大多數(shù)中藥材和植物中含量較高，但其溶解性差，生物活性低，通常在提取分離中基本作為低活性或無(wú)活性成分去除。通過(guò)輻照降解提高該部分多糖的溶解性和生物活性，將有利于天然多糖資源的利用和開(kāi)發(fā)。