朱貴花 黃從書 劉桂芳 謝光輝 馬增春 楊 凌 高 月

1（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

2（廣東藥科大學(xué) 廣州 510006）

3（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京 100850）

4（空軍杭州特勤療養(yǎng)中心 杭州 310002）

放射性皮膚損傷不僅是核爆炸、核事故、核燃料處理中的主要傷情，95%以上的臨床放療患者也會出現(xiàn)放射性皮膚損傷。輕度損傷可自愈，重則劇烈疼痛，繼發(fā)感染，潰瘍，壞死［1］。放射性皮膚損傷具有預(yù)后不良、易反復(fù)、難以治愈等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響涉核人員工作效能和公眾健康［2］。因此，對急性放射性皮膚損傷評估體系、發(fā)生發(fā)展機(jī)制及防治藥物的研究越來越受到國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者的關(guān)注，其研究的首要目標(biāo)是建立可評價的動物模型，探索其變化特征，以利于藥物開發(fā)研究。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，X射線及60Coγ射線均可用于放射性皮膚損傷模型的建立，兩種射線對機(jī)體的損傷有其不同的特點(diǎn)和規(guī)律。X射線是臨床上放化療時最常用的射線，能量高、劑量分布均勻、對稱性好、穿透性強(qiáng)。目前常選用X射線建立該模型并進(jìn)行相關(guān)研究，并取得了較好的效果。而60Coγ射線在放射性皮膚損傷模型的建立及相關(guān)報道較少，但臨床上有些地區(qū)仍然使用60Coγ射線進(jìn)行放射治療［3-6］。因此，本研究采用60Coγ射線進(jìn)行造模，通過觀察不同劑量的60Coγ射線引起的放射性皮膚損傷，從而找到建立大鼠放射性皮膚損傷模型的最佳方案，為放射性皮膚損傷的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

清潔級雌性Wistar大鼠，8周齡，體重（200±20）g，購自北京維通利華有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所27號院動物房。實(shí)驗(yàn)經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所動物倫理委員會審核批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號：IACUC-DWZX-2020-773。

1.2 儀器

60Coγ射線放射源（軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所）；激光多普勒血流儀MOORLDI2-BI（摩爾科學(xué)儀器有限公司）；脫水機(jī)VIP-6（日本櫻花）；包埋機(jī)KD-BM及組織攤片機(jī)KD-P（科迪儀器設(shè)備有限公司）；病理切片機(jī)RM2016（科迪儀器設(shè)備有限公司）；顯微鏡Nikon Ci-S及成像系統(tǒng)DS-FI2（日本尼康）。

2 方法

2.1 動物分組

Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：正常對照組（Normal control，NC，n=6）、30 Gy照 射 組（Radiation，30 Gy，n=10）和45 Gy照 射 組（Radiation，45 Gy，n=10）。正常對照組不接受照射，其余各組接受臀背部照射。照射前將所有動物使用電推刀將大鼠臀背部皮膚去毛。

2.2 動物皮膚輻射損傷模型的建立

照射前使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。除正常組外，所有大鼠俯臥位固定于特制模板上，采用60Coγ射線單次局部輻照大鼠臀背部皮膚，非照射部位用10 cm厚的鉛磚屏蔽，源皮距為2 m，照射面積為5 cm×3 cm，吸收劑量率217.34 cGy/min，兩組實(shí)際輻照時間分別為20.49 min和13.48 min，總劑量分別為45 Gy和30 Gy，建立放射性皮膚損傷模型。

2.3 觀察指標(biāo)

（1）觀察照后大鼠一般情況，包括大鼠的飲食攝水及體重變化情況，記錄大鼠照射區(qū)皮膚變化情況并采用皮膚半定量評分方法［3-4］：1分為正常皮膚；1.5分為輕度紅斑、干燥；2分為中度紅斑、干燥；2.5分為明顯紅斑、干燥脫屑；3分為干燥脫屑、輕度干燥結(jié)痂；3.5分為干燥脫屑、結(jié)痂，表皮少量結(jié)痂；4分為斑片狀濕潤脫屑，中度結(jié)痂；4.5分為融合性濕性脫屑，潰瘍，大量深的結(jié)痂；5分為開放性傷口，全層皮膚脫落。（2）照射區(qū)皮膚血流檢測：使用激光多普勒血流儀測定照后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d、60 d大鼠臀背部血流變化。（3）皮膚組織病理學(xué)觀察：各組大鼠于照后60 d，取照射區(qū)域皮膚組織，使用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后進(jìn)行切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)改變。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Graphpad prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，大鼠體重、皮膚評分、血流變化采用多因素方差分析進(jìn)行組間比較，大鼠表皮、真皮厚度采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01時差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 動物一般情況

與NC組相比，30 Gy和45 Gy照射組大鼠在照后2周攝食、飲水均減少，體重下降，45 Gy照射組下降更明顯（與NC相比，**p＜0.01，***p＜0.001），活動減弱，后慢慢恢復(fù)正常，體質(zhì)量呈逐漸增加的趨勢（圖1）。在照后第14天出現(xiàn)皮膚損傷后，30 Gy和45 Gy照射組大鼠性情暴躁，精神亢奮，活動增多。

圖1 照后不同時間各組大鼠體重變化Fig.1 Changes of body weight at different time after irradiation of all group rats

3.2 不同劑量60Coγ射線對大鼠皮膚損傷的影響

大鼠經(jīng)不同劑量的60Coγ射線照射后，均出現(xiàn)不同程度的皮膚損傷（圖2）。照后7 d，各組大鼠照射區(qū)皮膚均無明顯變化；照后14～18 d，30 Gy組大鼠出現(xiàn)輕度脫屑，45 Gy組大鼠脫屑明顯，并伴有輕度紅斑，傷口均未出現(xiàn)破損；照后21 d，30 Gy組大鼠出現(xiàn)顯著性紅斑、脫皮，皮膚輕微破損但無滲出液，皮膚損傷評分達(dá)最大（圖3），45 Gy組大鼠傷口破損、局部膿腫，伴有滲出液；照后28 d，30 Gy組大鼠創(chuàng)面面積穩(wěn)定，傷口輕度結(jié)痂，45 Gy組大鼠創(chuàng)面結(jié)痂，傷口范圍穩(wěn)定，皮膚損傷評分達(dá)最大值（圖3）；照后60 d，30 Gy組大鼠創(chuàng)面有新生上皮長出，與正常皮膚相似，45 Gy組大鼠創(chuàng)面有部分傷口仍未愈合。

圖2 照后不同時間各組大鼠皮膚變化Fig.2 Changes of skin at different time after irradiation of all group rats

圖3 使用皮膚半定量評分評估各組皮膚損傷程度1.0（無損傷）至5.0（嚴(yán)重?fù)p傷）Fig.3 Assessment of skin injury in each group using semiquantitative grading from 1.0(no injury)to 5.0(severe injury)

3.3 照后不同時間各組大鼠皮膚血流變化

照后不同時間各組大鼠皮膚血流變化情況見圖4和圖5。照后60 d，與NC組相比，各組大鼠血流均出現(xiàn)明顯變化（圖4）。由圖4可知，照后7 d，兩組大鼠皮膚血流與正常接近；照后14 d，兩組大鼠皮膚血流升高，這時皮膚出現(xiàn)脫屑，血管擴(kuò)張；照后21～28 d，30 Gy組大鼠血流維持在較高水平，考慮與大鼠創(chuàng)面出現(xiàn)紅斑有關(guān)；照后35～60 d，30 Gy組大鼠皮膚血流與正常逐漸接近，說明傷口逐漸恢復(fù)、開始愈合；照后21 d，45 Gy組大鼠血流減少，考慮與大鼠出現(xiàn)潰瘍有關(guān)。

圖4 照后不同時間各組大鼠皮膚血流變化Fig.4 Changes of the skin blood flow at different time after irradiation of all group rats

圖5 照后不同時間點(diǎn)各組大鼠血流值變化情況；***p＜0.001，與正常相比Fig.5 Changes of the skin blood flow values at different time after irradiation of all group rats;***p＜0.001,compared with NC group

照后28 d，45 Gy組大鼠血流增加（***p＜0.001），考慮與大鼠創(chuàng)面愈合過程中肉芽組織大量增生有關(guān)。照后35～60 d，45 Gy組大鼠血流與30 Gy組相似（圖5）。

3.4 觀察各組皮膚組織病理形態(tài)學(xué)改變

正常的皮膚組織皮膚層結(jié)構(gòu)正常，真皮層含有一定數(shù)量的毛囊、皮脂腺、汗腺，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，皮下組織血管無充血、淤血及炎性細(xì)胞浸潤；照后60 d，30 Gy組大鼠局部可見表皮層增厚（p＜0.001），鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)量增多（黑色箭頭）；真皮層膠原纖維含量豐富、排列規(guī)則，可見毛囊、皮脂腺等附屬器官，未見明顯炎癥。45 Gy組大鼠可見表皮明顯增厚，鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)量增多（黑色箭頭），少見鱗狀上皮細(xì)胞胞質(zhì)空泡化（黃色箭頭）；真皮層可見少量纖維細(xì)胞（紅色箭頭），并伴有淋巴細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤（藍(lán)色箭頭），未見毛囊、皮脂腺等附屬器官（圖6）。正常的皮膚組織表皮層較薄，真皮層內(nèi)可見大量的皮膚附屬器如皮脂腺、毛囊、汗腺等，它們的存在對于維持皮膚的正常功能具有重要作用。經(jīng)照射后，可以發(fā)現(xiàn)45 Gy組大鼠表皮層明顯增厚（p＜0.001），且皮膚附屬器數(shù)量減少，使皮膚失去了正常功能（圖7）。

圖6 照后60 d各組大鼠皮膚組織病理改變；彩色見網(wǎng)絡(luò)版（HE,200×）Fig.6 Pathological changes of rats skin tissues at 60 d after irradiation of all group rats;color online(HE,200×)

圖7 照后60 d各組大鼠表皮厚度；***p＜0.001，與正常相比Fig.7 The average of epidermal thickness at 60 d after irradiation of all group rats;***p＜0.001,compared with NC group

4 討論

放射性皮膚損傷是放射性損傷中較為常見的一種類型，主要發(fā)生于單次大劑量照射或多次小劑量照射的患者及與輻射相關(guān)的工作者。當(dāng)射線作用于皮膚時，會使皮膚血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損害，導(dǎo)致毛細(xì)血管損傷，血管通透性增加，炎性滲出，微血栓形成及微血管阻塞，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚微循環(huán)障礙，加重皮膚損傷。臨床表現(xiàn)為紅斑、瘙癢、脫屑、潰瘍、壞死等［7］癥狀。病理學(xué)變化為表皮增生、纖維化、炎性浸潤、皮膚附屬結(jié)構(gòu)減少等［8］。因此，為深入探討放射性皮膚損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療方法，需要建立放射性皮膚損傷的動物模型。

對于放射性皮膚損傷動物模型的建立，在動物種類的選擇上主要有小鼠、大鼠、新西蘭大白兔及小型豬［9-12］。小鼠體積小，不易照到局部皮膚；而新西蘭大白兔、小型豬體積大，操作不便。照射部位多選用臀背部或雙后肢，該部位重要臟器少，便于觀察。因此，本次實(shí)驗(yàn)選用雌性Wistar大鼠作為造模動物，臀背部皮膚作為照射區(qū)域。

目前，放射性皮膚損傷模型的建立主要集中于X射線的研究。相關(guān)學(xué)者分別選用單次劑量45 Gy、38 Gy、40 Gy、41.5 Gy成功建立了放射性皮膚損傷模型［13-16］。賴梅生等［17］選用單次吸收劑量38 Gy的X射線，觀察荊芥連翹湯預(yù)防性內(nèi)服對大鼠放射性皮炎的防治作用；李洋等［18］選用單次吸收劑量40 Gy的X射線，探討水凝膠治療大鼠放射性皮炎愈合過程中創(chuàng)面愈合率及其機(jī)制。因不同直線加速器產(chǎn)生的X射線，選用的劑量存在一定的差別，但可以發(fā)現(xiàn)不管是造模劑量還是藥物觀察劑量，選用X射線建立放射性皮膚損傷模型的最佳劑量為40 Gy左右。因60Co源的特殊性，對不同劑量60Coγ射線誘發(fā)放射性皮膚損傷的報道較少。部分研究者分別使用單次劑量60 Gy、45 Gy、30 Gy、22 Gy60Coγ射線進(jìn)行造模［19-22］，可以發(fā)現(xiàn)劑量梯度較大。因此，本實(shí)驗(yàn)選用60Coγ射線進(jìn)行造模。結(jié)合前期相關(guān)劑量摸索的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)當(dāng)吸收劑量小于20 Gy時，大鼠的皮膚改變及病理變化極其輕微，不足以反映放射性皮膚損傷的特征。當(dāng)吸收劑量為30 Gy、45 Gy時，其皮膚變化與病理改變較為明顯。因此，本次實(shí)驗(yàn)選用30 Gy、45 Gy作為進(jìn)一步研究的劑量。

輻射會導(dǎo)致皮膚微循環(huán)障礙，通過檢測照射野大鼠皮膚血流變化，可以得出：與正常組相比，30 Gy組、45 Gy組大鼠照射區(qū)皮膚血流在紅斑期及愈合期血流增加，30 Gy組在輻射中期維持在較高水平，45 Gy組大鼠照射區(qū)皮膚血流在潰瘍期降低。因此，我們可以得出照射區(qū)皮膚血流在紅斑出現(xiàn)時，血流增加；在潰瘍出現(xiàn)時，血流降低；創(chuàng)面愈合初期時，血流增加，創(chuàng)面愈合后期時降低。

本研究結(jié)果顯示，30 Gy組、45 Gy組均能建立放射性皮膚損傷模型，但其損傷程度不同。30 Gy組60Coγ射線照射組大鼠皮膚損傷較輕，真皮層可見毛囊、皮脂腺等附屬器官，為輕度炎癥病變。45 Gy組照射野皮膚遵循紅斑、瘙癢、炎性、潰瘍及愈合等規(guī)律；鏡下可見表皮增厚，局部真皮層可見少量纖維細(xì)胞，并伴有淋巴細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤，皮膚附屬器減少，為中度炎癥病變。結(jié)合照后大鼠皮膚變化、血流變化和病理變化，可以發(fā)現(xiàn)45 Gy組更符合放射性皮膚損傷的發(fā)生發(fā)展過程。綜上所述，采用45 Gy的60Coγ射線可獲得較佳的放射性皮膚損傷模型，該模型易于觀察，取材方便，皮膚損傷明顯，可為放射性皮膚損傷的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。