高 兵，韓志芬，曲 濱，李 巍，杜廣剛

燒傷創(chuàng)面愈合是一個(gè)動(dòng)態(tài)和復(fù)雜的過程，涉及損傷區(qū)周圍的各種介質(zhì)和多種細(xì)胞類型。關(guān)于燒傷創(chuàng)面愈合、瘢痕形成細(xì)胞和分子機(jī)制仍然知之甚少，因此，尋找可能改善身體的自然修復(fù)機(jī)制的臨床策略將需要基于對(duì)修復(fù)和再生的基本生物學(xué)的透徹理解。燒傷創(chuàng)面滲出液代表著燒傷創(chuàng)面的微環(huán)境，從中提取與細(xì)胞組分、信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)等相關(guān)信息有助于判斷燒傷損害程度、創(chuàng)面深度和可能的全身并發(fā)癥。由于創(chuàng)面滲出液影響創(chuàng)面愈合及創(chuàng)基生理，現(xiàn)在新的治療方法正在向改善創(chuàng)面滲出液轉(zhuǎn)變。此外，研究證實(shí)燒傷創(chuàng)面滲出液與瘢痕形成有關(guān)。目前已知的燒傷創(chuàng)面滲出液分子生物學(xué)相關(guān)知識(shí)還知之甚少，我們推測(cè)對(duì)燒傷滲出液的研究可能與燒傷創(chuàng)面愈合、瘢痕形成、燒傷創(chuàng)面轉(zhuǎn)變和燒傷創(chuàng)面深度判斷的機(jī)制關(guān)聯(lián)密切。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用改變了探尋指示創(chuàng)面愈合以及對(duì)治療的反應(yīng)標(biāo)志物?；诖耍撗芯坷媚┒税返孜锿凰貥?biāo)記技術(shù)(terminal amine isotopic labeling of substrates，TAILS)評(píng)估創(chuàng)面愈合滲出液蛋白水解事件，通過同位素標(biāo)記相對(duì)或絕對(duì)定量技術(shù)(isobarictag for relative and absolute quantitation，iTRAQ)定量分析燒傷創(chuàng)面愈合不同時(shí)期創(chuàng)面滲出液蛋白質(zhì)和蛋白N端動(dòng)態(tài)變化，旨在為判斷燒傷患者創(chuàng)面愈合情況提供新的臨床檢驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 體豬創(chuàng)面模型制備及滲出液提取

西藏小型豬8頭，雄性，體質(zhì)量10～15 kg，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(川)2009-09]，實(shí)驗(yàn)前在四川省人民醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為4組，每組2頭：傷后第0～2天(2 d)、第2～4天(4 d)、第4～6天(6 d)、第6～8天(8 d)。動(dòng)物經(jīng)氯胺酮、速眠新麻醉后雙側(cè)背部備皮，在背部中線兩側(cè)平行線上用固體酒精燃燒30 s制作4組5 cm大小深二度皮膚燒傷創(chuàng)面。將環(huán)氧乙烷滅菌的泡沫敷料切成適當(dāng)?shù)某叽绮⒅糜趧?chuàng)面內(nèi)。創(chuàng)面用黏性聚氨酯膜密封，中心穿1 cm孔，連接引流管系統(tǒng)，在真空裝置幫助下施加125 mmHg的負(fù)壓。在第2、4、6、8天取出泡沫，儲(chǔ)存在-80 ℃用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。對(duì)于4、6、8 d創(chuàng)面，分別在傷后第2、4、6天更換泡沫。從泡沫中提取創(chuàng)面滲出液：將用創(chuàng)面液浸泡的冷藏泡沫置于用塑料塞密封的2 ml注射器中，并在1～2 ml提取緩沖液[50 mmol/L HEPES，pH 7.8，10 mmol/L EDTA 蛋白酶抑制劑(德國(guó)Roche公司)]在4 ℃下在旋轉(zhuǎn)器上培養(yǎng)1～3 h。隨后，取出塞子，用注射器轉(zhuǎn)移至15 ml Falcon管中，通過離心(7 min，250 r/min，4 ℃)收集創(chuàng)面液。通過第2次離心(10 min，15 000 r/min，4 ℃)除去不溶性顆粒，將提取的創(chuàng)面滲出液儲(chǔ)存在-80 ℃。

1.2 創(chuàng)面滲出液的加工和蛋白質(zhì)量的平衡

匯集來自同一豬的創(chuàng)面滲出液，將緩沖液更換為50 mmol/L HEPES，pH 7.8，利用5 kDa分子量截留濃縮器(德國(guó)Vivaspin公司)通過超濾除去低分子量組分。通過離心(10 min，15 000 r/min，4 ℃)除去固體顆粒，Bradford分析法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(美國(guó)BioRad公司)，樣品直接進(jìn)一步處理或儲(chǔ)存在-80 ℃。用組合肽配體庫(kù)技術(shù)平衡蛋白質(zhì)量，使用ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit(BioRad)處理樣品。將創(chuàng)面滲出液樣品調(diào)節(jié)至在50 mmol/L HEPES，pH 7.8中的50～70 mg/ml的蛋白質(zhì)濃度，并裝載到ProteoMiner離心柱上。根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行柱制備、樣品結(jié)合、洗滌和洗脫。與肽配體文庫(kù)結(jié)合的蛋白質(zhì)在300 μl洗脫緩沖液(8 mol/L尿素，2% CHAPS)中洗脫，并通過Bradford測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。加工的樣品在300 μl中含有0.95～2.00 mg總蛋白質(zhì)。最后，如上所述通過超濾將ProteoMiner處理的樣品緩沖交換為250 mmol/L HEPES(pH 7.8)和2.5 mol/L鹽酸胍，重新評(píng)估蛋白質(zhì)濃度，用相同緩沖液調(diào)節(jié)至1 mg/ml，并儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆谩?p>1.3 4plex-iTRAQ-TAILS方法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行iTRAQ-TAILS分析。將0.5 mg處理的創(chuàng)面滲出液的等分試樣以1 ∶4的蛋白/ iTRAQ(w/w)比例用4plex-iTRAQ試劑標(biāo)記。樣品用胰蛋白酶Trypsin(美國(guó)Promega公司)和1/10的肽混合物用于在N-末端富集之前進(jìn)行分析。將435 kDa的HPG-ALD聚合物以3倍過量(w/w)以在先前描述的條件下耗盡剩余樣品的內(nèi)部胰蛋白酶肽(TAILS)。將樣品冷凍并儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆谩?p>1.4 強(qiáng)陽離子交換色譜和質(zhì)譜分析

在進(jìn)行質(zhì)譜分析之前，將肽段加載到1100 HPLC系統(tǒng)(美國(guó)Agilent Technologies公司)上并通過200 Poly PolySULFOETHYL A強(qiáng)陽離子交換色譜柱(200 mm×2.1 mm，5 μm，美國(guó)PolyLC Inc公司)進(jìn)行分餾。用100%緩沖液A(10 mmol/L磷酸鉀，25%乙腈，pH 2.7)洗脫60 min，然后在5 min內(nèi)將緩沖液B(緩沖液A+0.5 mol/L氯化鉀)逐漸增加至5%，在隨后35 min內(nèi)達(dá)到35%，并在最后10 min內(nèi)達(dá)到100%。使用COMIX吸頭(Agilent Technologies)收集了27個(gè)餾分，并根據(jù)214 nm/280 nm吸收色譜圖將其合并為8個(gè)餾分。在LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)與Eksigent-Nano-HPLC系統(tǒng)(美國(guó)Eksigent Technologies公司)分析了N末端肽陰性富集后獲得的樣品。

1.5 MS數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Mascot(V2.3.2)進(jìn)行檢索。檢索結(jié)果用Scaffold 4.3.2軟件分析，利用Decoy數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略。應(yīng)用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.pantherdb.org/)，初步分析差異蛋白所屬細(xì)胞成分，參與的生物學(xué)過程及相應(yīng)的分子功能。應(yīng)用IPA數(shù)據(jù)庫(kù)搜索差異蛋白相關(guān)信息，重要差異蛋白所屬信號(hào)通路。具有重要意義的信號(hào)通路通過檢索Pubmed相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證及進(jìn)一步分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將每種肽或蛋白質(zhì)的通道歸一化為所有通道的中值，從而提供了針對(duì)異常值的可靠策略，并允許在使用不同通道數(shù)的實(shí)驗(yàn)之間進(jìn)行比較。對(duì)于人類樣品，將iTRAQ報(bào)告基因強(qiáng)度進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化為參考通道的強(qiáng)度。篩選N末端列表以獲取內(nèi)部neo-N-末端(位置≥3)。使用Multi Experiment Viewer v4.8(單向ANOVA)測(cè)定豬樣品中差異豐富的蛋白質(zhì)、neo-N-末端和比率。使用R語言中的heatmap2生成歸一化途徑富集

P

值的熱圖。矩陣相關(guān)性在R中執(zhí)行，并使用corrplot可視化。使用Prism 5.0創(chuàng)建豐度分布圖。

2 結(jié)果

2.1 豬燒傷創(chuàng)面滲出液iTRAQ-TAILS分析

圖1顯示了燒傷后0、2、4、6和8 d創(chuàng)面部位愈合情況，觀察到創(chuàng)面隨時(shí)間推移逐漸愈合。為了評(píng)估燒傷創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)(圖1)，我們使用泡沫收集燒傷后多個(gè)時(shí)間段的創(chuàng)面滲出液，并在4plex iTRAQ-TAILS實(shí)驗(yàn)中測(cè)定它們的蛋白質(zhì)組和neo-N-末端組。研究從豬創(chuàng)面滲出液中收集了1 060種可定量蛋白質(zhì)和1 667種neo-N-末端的數(shù)據(jù)集(圖2)，這些數(shù)據(jù)總共對(duì)應(yīng)1 206個(gè)高可信度蛋白質(zhì)鑒定。

圖1 燒傷后0、2、4、6和8 d創(chuàng)面部位愈合情況

圖2 豬燒傷創(chuàng)面滲出液的iTRAQ-TAILS數(shù)據(jù)集

每個(gè)樣品和重疊樣品中鑒定出的蛋白質(zhì)和新N末端的數(shù)量；A定義了每個(gè)相交集的條目數(shù)；S定義最大的單個(gè)集合；U定義數(shù)據(jù)集的整體大小(Σ)

2.2 定量評(píng)估豬燒傷創(chuàng)面的模型建立

研究利用了基于iTRAQ的燒傷后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面滲出液中蛋白質(zhì)和neo-N-末端的相對(duì)定量建立了豬燒傷創(chuàng)面進(jìn)展的定量評(píng)估模型。通過單向方差分析，確定了416種蛋白質(zhì)和371種neo-N-末端的豐度隨時(shí)間發(fā)生顯著變化以及188個(gè)neo-N-末端子集[它們相對(duì)于整個(gè)蛋白質(zhì)的豐度發(fā)生了顯著變化(裂解)]。隨后，研究使用模糊c均值聚類將差異豐富的蛋白質(zhì)、neo-N-末端和裂解分配給時(shí)間分辨豐度分布的聚類(圖3A)。差異豐富的蛋白質(zhì)和neo-N-末端聚集非常相似，D2(聚類1)、D4(聚類2)、D4和D6(聚類3)具有很高的豐度；隨著時(shí)間的推移，豐度持續(xù)增加(聚類4)； 第8天的豐度顯著增加(聚類5)。IPA富集分析顯示，與炎癥相關(guān)的通路(巨噬細(xì)胞中的活性氧/一氧化氮合酶、急性期信號(hào)傳導(dǎo)、補(bǔ)體系統(tǒng))和損傷有關(guān)的通路(凝血系統(tǒng))在燒傷后第4、6天(聚類2和3)具有高豐度以及與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)在監(jiān)測(cè)的愈合階段(第8天)(聚類4和5)具有高豐度(圖3B)。

圖3 時(shí)間分辨豐度聚類和IPA分析A:使用模糊c均值聚類將差異豐富的蛋白質(zhì)、neo-N-末端和裂解分配給時(shí)間分辨豐度分布的聚類;B:IPA富集分析豬創(chuàng)面模型中聚集蛋白、neo-N-末端和裂解

2.3 黏著連接成分作為燒傷創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)標(biāo)志物

為了進(jìn)一步明確燒傷創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)標(biāo)志物，研究采用歸一化富集

P

值的相關(guān)矩陣對(duì)豬燒傷創(chuàng)面模型和患者數(shù)據(jù)得出的時(shí)間分辨蛋白豐度譜的相關(guān)性進(jìn)行分析(圖4A)。結(jié)果顯示，上皮黏著連接動(dòng)態(tài)相關(guān)的蛋白質(zhì)豐度變化具有極高的相關(guān)性(0.84～0.98)。研究采用iTRAQ-TAILS評(píng)價(jià)豬創(chuàng)面滲出液中上皮黏著連接蛋白的豐度分布，發(fā)現(xiàn)包括黏附蛋白Zyxin(focal adhesion protein zyxin，ZYX)、Ras GTPase激活蛋白IQGAP1(Ras GTPase-activating-like protein IQGAP1，IQGA1)、絲氨酸蛋白酶絲氨酸肽酶1(high temperature factor A-1，HTRA1)以及多種微管蛋白和肌動(dòng)蛋白亞型(為上皮黏著連接蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的一部分)均在豬模型燒傷后收集的創(chuàng)面滲出液的豐度都增加了。采用iTRAQ-TAILS評(píng)價(jià)不同愈合動(dòng)力學(xué)(快速愈合：在燒傷后第5天和第8天停止創(chuàng)面負(fù)壓吸引治療；緩慢愈合：在燒傷后第17天甚至第25天停止創(chuàng)面負(fù)壓吸引治療)人創(chuàng)面滲出液中選定候選蛋白ZYX、IQGA1以及HtrA1的豐度分布。與第一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)相比，在治療結(jié)束時(shí)收集的滲出液中，所有三種蛋白質(zhì)的含量都大大增加。結(jié)果表明，這些蛋白質(zhì)潛在地適合作為創(chuàng)面負(fù)壓吸引治療患者創(chuàng)面滲出液中愈合進(jìn)程的標(biāo)志，但仍需轉(zhuǎn)移到具有更大患者隊(duì)列的擴(kuò)展研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

圖4 燒傷創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)標(biāo)志物確認(rèn)A:豬和人類數(shù)據(jù)集之間蛋白質(zhì)水平的富集途徑的相關(guān)性;B:iTRAQ-TAILS分析豬創(chuàng)面滲出液中上皮黏著連接蛋白的豐度分布;C～F:iTRAQ-TAILS分析快速和緩慢愈合動(dòng)力學(xué)患者中選定候選蛋白ZYX、IQGA1以及HtrA1的豐度分布

3 討論

在這項(xiàng)研究中，我們采用一種基于時(shí)間分辨質(zhì)譜的降解分析方法對(duì)燒傷后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面滲出液N-末端進(jìn)行整體分析，并對(duì)復(fù)雜的組織反應(yīng)進(jìn)行降解分析。研究利用臨床相關(guān)的豬燒傷創(chuàng)面愈合模型和高度敏感的多重iTRAQ-TAILS方法，從創(chuàng)面滲出液中鑒定出大約3 000種蛋白質(zhì)，極大擴(kuò)展了我們對(duì)創(chuàng)面滲出液蛋白質(zhì)組含量的了解。我們的數(shù)據(jù)可用于在創(chuàng)面愈合過程中鑒定關(guān)鍵蛋白，臨床前研究的設(shè)計(jì)以及用于解釋臨床數(shù)據(jù)的框架。在該模型中，我們觀察到蛋白質(zhì)豐度主要在D4和D6處增加(聚類3)，但在D8處蛋白質(zhì)差異水解(聚類4)，提示蛋白水解事件可能對(duì)創(chuàng)面愈合的進(jìn)展很重要。將此方法擴(kuò)展到與蛋白水解活性異常相關(guān)的其他疾病(例如癌癥、關(guān)節(jié)炎和炎癥性疾病)有可能識(shí)別疾病進(jìn)展過程中蛋白水解活性的關(guān)鍵波動(dòng)。

當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)主要問題是無法將結(jié)果從基礎(chǔ)研究模型轉(zhuǎn)移到臨床。對(duì)來自人類臨床模型的樣本進(jìn)行直接分析通常會(huì)表現(xiàn)出較高的異質(zhì)性，而簡(jiǎn)單的動(dòng)物模型可能會(huì)提供高度可重復(fù)的均質(zhì)結(jié)果，但通常無法充分代表人類的狀況。本研究通過使用非常類似于臨床治療方案的豬燒傷創(chuàng)面模型克服了這個(gè)問題，因此，可以識(shí)別具有高度有效性的事件來解釋臨床數(shù)據(jù)集。兩種模型之間的高度相似性，通過利用同質(zhì)豬數(shù)據(jù)集作為人類數(shù)據(jù)建模的模板，使我們能夠從人類數(shù)據(jù)中提取事件，這些事件在受傷后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間具有不同的豐度，進(jìn)一步增強(qiáng)了我們完善的豬數(shù)據(jù)集的價(jià)值，將其作為應(yīng)用創(chuàng)面負(fù)壓吸引治療方案的患者創(chuàng)面滲出液的蛋白質(zhì)組學(xué)和降解組學(xué)分析的可靠標(biāo)準(zhǔn)。

創(chuàng)面緩慢愈合與炎癥和組織降解失衡密切相關(guān)。因此，本研究旨在確定創(chuàng)面進(jìn)展的指示性生物標(biāo)志物，特別是在創(chuàng)面滲出液中炎癥介質(zhì)和組織降解蛋白酶變化。這些改變是繼發(fā)于肉芽組織形成的延遲或缺乏和再上皮化的開始，反映了治療進(jìn)展中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。在本研究中，豬模型與患者數(shù)據(jù)之間相關(guān)性最高的標(biāo)記物與表皮細(xì)胞(ZYX、IQGA1)和真皮成纖維細(xì)胞(HtrA1)的遷移和增殖直接相關(guān)，因此是這些過程的主要指標(biāo)。其中，HtrA1是經(jīng)典分泌的蛋白質(zhì)，ZYX和IQGA1均主要與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)。在功能上，ZYX與局灶性黏連與細(xì)胞核間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，被認(rèn)為是成熟局灶性黏連最顯著的標(biāo)志物。ZYX在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮重要作用，先前研究發(fā)現(xiàn)，MDCK細(xì)胞中ZYX的敲除導(dǎo)致刮痕閉合延遲。另一項(xiàng)研究表明，與其他重要的黏著連接成分(例如，踝蛋白和樁蛋白)相反，ZYX有助于控制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)路徑。我們的分析證實(shí)了ZYX在增生性傷口上皮中的功能性作用，因此有必要進(jìn)一步剖析其潛在機(jī)制。肉芽組織的形成是創(chuàng)面愈合的最重要事件之一。HtrA1可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)，并切割細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)和蛋白多糖，例如形成Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型前膠原的C-前肽。此外，HtrA1被描述為一種可能的腫瘤抑制因子，通過半胱天冬酶依賴性或非依賴性凋亡和失巢誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，HtrA1可能在細(xì)胞外基質(zhì)重塑、細(xì)胞增殖和創(chuàng)面愈合增殖期炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究利用iTRAQ-TAILS分析系統(tǒng)對(duì)燒傷創(chuàng)面滲出液中的蛋白質(zhì)組及其蛋白水解調(diào)節(jié)作用進(jìn)行時(shí)間分辨降解分析。通過分析來自豬燒傷模型的創(chuàng)面滲出液，TAILS鑒定了體內(nèi)許多已知和新穎的蛋白水解加工事件，反映了這種高度復(fù)雜的組織反應(yīng)中蛋白酶活性的關(guān)鍵域。此外，研究還確定接受創(chuàng)面負(fù)壓吸引治療的燒傷患者創(chuàng)面進(jìn)展的指示性生物標(biāo)記物候選物，為判斷燒傷患者創(chuàng)面愈合情況的提供新的臨床檢驗(yàn)方法。