謝克英 婁芳慧 孫瑞琳 錢志偉

關(guān)鍵詞：桑葉;1-脫氧野尻霉素;生產(chǎn)工藝;研究進(jìn)展

桑樹屬于?？浦参锷?，桑葉性寒、味甘苦，具有疏風(fēng)散熱、潤(rùn)肺祛燥、清肝明目的功效，古醫(yī)藥著作《神農(nóng)本草經(jīng)》稱其為神仙葉。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，桑葉中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，桑葉作為中藥材已被國(guó)家藥典正式收錄，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥、食兩用寶貴資源[1]?，F(xiàn)有研究報(bào)道從桑葉中提取的生物堿，尤其是多羥基生物堿1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ） 具有良好的降血糖、降血脂和抗氧化等作用[2]。

一、1-DNJ的來(lái)源

日本Yoshiaki等人在1976年首次從桑根皮中分離提純得到1-DNJ[3]。桑樹各個(gè)器官均含有1-DNJ，但其含量因品種、栽培區(qū)域以及樹體藥用部位不同存在差異。對(duì)桑葉來(lái)說(shuō)，葉位、發(fā)育階段、采收時(shí)間和季節(jié)這些因素都對(duì)1-DNJ 含量有影響。1-DNJ 來(lái)源于植物和微生物[4]，除桑樹外，野跖草、風(fēng)信子、沙參屬植物也含有1-DNJ及其類似物，但其含量均低于桑樹;微生物發(fā)酵產(chǎn)生的1-DNJ含量更低，在0.01mg/mL左右。

二、1-DNJ的藥理學(xué)功能

1-DNJ的結(jié)構(gòu)與α-1，4-葡萄糖近似，在機(jī)體內(nèi)與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)酶上的催化位點(diǎn)。1-DNJ不僅能夠調(diào)節(jié)餐后血糖水平異常升高，亦可改善糖尿病常見并發(fā)癥。降低食物中碳水化合物分解速率，抑制餐后血糖升高，減少葡萄糖攝入的關(guān)鍵是抑制α-葡萄糖苷酶活性[5]。1-DNJ可以促進(jìn)B細(xì)胞分泌胰島素，從而起到降血糖的效果。糖尿病小鼠的血糖、血甘油三酯水平在1-DNJ作用下顯著降低，提高小鼠肝臟的葡萄糖代謝酶活力和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，從而提高動(dòng)物的脂聯(lián)素水平，激活β-氧化系統(tǒng)，抑制肝臟脂質(zhì)積累。利用糖尿病小鼠開展的降糖機(jī)理研究表明，1-DNJ可以降低腸道對(duì)葡萄糖吸收，調(diào)節(jié)參與糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解及糖異生代謝過(guò)程的酶，有利于肝內(nèi)葡萄糖代謝，血糖濃度得以降低。李有貴等[6]研究表明桑葉輔助降血脂活性，桑葉總生物堿對(duì)高脂飼料造模的SD大鼠的血清總膽固醇降低達(dá)35.3%，高密度脂蛋白膽固醇提升達(dá)27.53%，降血脂活性明顯。王輝等[7]研究的20個(gè)品種桑葉浸提液均具有抗病毒活性，不同病毒的活性抑制具有一定的選擇性，推測(cè)桑葉1-DNJ為病毒抑制的主要活性成分。陳玉華[6]對(duì)1-DNJ抗腫瘤活性研究試驗(yàn)表明，1-DNJ能夠抑制人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，1-DNJ能調(diào)節(jié)胰腺癌SW1990細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。

三、1-DNJ的提取與純化

（一） 1-DNJ的提取

關(guān)于桑葉中1-DNJ的提取，已有的報(bào)道中多是采用水提取法、有機(jī)溶劑提取法和酸提取法。1-DNJ存在于細(xì)胞內(nèi)，且溶于水。1-DNJ提取時(shí)需要先破壞細(xì)胞壁等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此微波、超聲等輔助手段有利于1-DNJ的提取。

微波輔助萃取是微波萃取與傳統(tǒng)溶劑萃取相結(jié)合，通過(guò)偶極子在材料或溶劑中誘導(dǎo)分子運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致樣品升溫，利用加熱使植物細(xì)胞蒸發(fā)失去水分;蒸汽產(chǎn)生膨脹，最終使細(xì)胞破裂并釋放其活性成分的一種新的萃取技術(shù)。與傳統(tǒng)萃取技術(shù)相比，該工藝具有萃取溫度低、萃取次數(shù)少、無(wú)熱慣性（易于控制）、效率高、溶劑用量少、操作成本低、工作空間小等優(yōu)點(diǎn)。胡瑞君等[9]利用微波輔助萃取的方法提取桑葉中1-DNJ。此法1-DNJ的提取受微波處理時(shí)間、功率、固液比和提取次數(shù)這些因素的影響，優(yōu)化后的最佳提取工藝1-DNJ的提取率為0.024%，其中微波處理時(shí)間為1.5min，功率為406W，固液比為1∶40，提取次數(shù)為2次。

超聲輔助萃取是一種利用聲波在樣本組織附近產(chǎn)生空化氣泡，并通過(guò)空化氣泡破壞細(xì)胞壁和產(chǎn)生空穴，從而增加質(zhì)量傳遞且釋放細(xì)胞內(nèi)容物，以達(dá)到在更短的時(shí)間內(nèi)從不同基質(zhì)中提取分析物的有效方法[10]。王璐等[11]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲細(xì)胞破碎機(jī)輔助低共熔溶劑提取桑葉1-DNJ，研究結(jié)果表明，氯化膽堿甘油和水組成低共熔溶劑提取效果最好，優(yōu)化條件后1-DNJ的提取量為1.445mg/g，其中，氯化膽堿與甘油比例為1∶3.4，含水量40%，超聲時(shí)間32min，重復(fù)3次。

超臨界流體萃取是一種廣泛應(yīng)用于食品原料、補(bǔ)充劑和植物藥劑等天然固體物質(zhì)提取的方法，因其具有更高的安全性、更短的提取時(shí)間和更高的選擇性而在提取生物堿等化合物上越來(lái)越受歡迎。

（二） 1-DNJ的純化

1-DNJ的純化，主要利用不同生物堿及其他次生代謝物分子量不同、吸附能力不同、鍵結(jié)合力不同，設(shè)計(jì)不同的層析柱或色譜柱進(jìn)行1-DNJ的純化。大孔樹脂，特別是常用的吸附型和離子交換型，分別對(duì)應(yīng)于非特異性物理吸附和離子交換的機(jī)理，在分離和純化天然產(chǎn)物中應(yīng)用較多[12]。祝上賓等[13]利用吸附樹脂分離純化桑葉中1-DNJ，并通過(guò)亞臨界水法提取桑葉中的1-DNJ，對(duì)比了離子交換型樹脂、吸附型樹脂以及兩種樹脂聯(lián)用純化提取液中DNJ的效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，吸附型樹脂所得1-DNJ含量較原提取液提高2.9 倍，陽(yáng)離子樹脂所得1-DNJ 含量較原提取液提高3.8倍，聯(lián)合使用兩種樹脂，所得1-DNJ含量較原提取液提高11.5倍。

從工藝復(fù)雜性來(lái)看，大孔樹脂吸附法、硅膠柱層析法、高效液相色譜法的操作均十分復(fù)雜，涉及多個(gè)步驟，因此，其耗費(fèi)的時(shí)間相對(duì)也比較長(zhǎng)，處理量較大。大孔樹脂吸附法與高速逆流色譜法使用的有機(jī)溶劑繁多，有些對(duì)人體健康和環(huán)境安全影響較大，故在食品與藥物產(chǎn)品的加工方面應(yīng)慎重使用。

原有的萃取技術(shù)大多需要使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑，容易污染環(huán)境，近年來(lái)出現(xiàn)的濁點(diǎn)萃取法恰好解決了這些問(wèn)題。金屬螯合物、生物大分子等在分離與純化及環(huán)境樣品的前處理應(yīng)用該法均已取得良好效果。液液分離過(guò)程中改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離，以濁點(diǎn)現(xiàn)象和中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性作為分離基礎(chǔ)，疏水性物質(zhì)和親水性物質(zhì)得到分離[14]。Na Guo等[15]建立了濁點(diǎn)萃取富集桑葉樣品中5種目標(biāo)化合物（脫氧野尻霉素、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和黃芪甲素） 的方法，最佳條件下，5個(gè)目標(biāo)化合物優(yōu)于常規(guī)溶劑提取。

離子液體具有低毒、低揮發(fā)性、環(huán)境友好，還具有可設(shè)計(jì)等特性，離子液體應(yīng)用在固相微量萃取、含水兩相萃取、液相微量萃取、分散相液液微量萃取、液液萃取等分離技術(shù)中以及核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、農(nóng)藥殘留、芳香族有機(jī)物、金屬離子等的萃取、檢測(cè)方面。國(guó)外已有大量報(bào)道，利用離子液體法及離子液體聯(lián)用微波、超聲波、酶、雙水相等方法提取黃酮、生物堿、多酚、萜類等天然產(chǎn)物。

四、1-DNJ的檢測(cè)

1-DNJ屬于哌啶型生物堿，這類生物堿不含苯環(huán)、雙鍵及羰基等發(fā)色團(tuán)，紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)光吸收低，無(wú)法用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。除此之外，哌啶生物堿結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基，分子極性較大，光度檢測(cè)方法定性定量較困難。紫外分光光度法所用儀器相對(duì)簡(jiǎn)單，但由于受發(fā)色基團(tuán)及其他有色物質(zhì)干擾等問(wèn)題存在檢測(cè)靈敏度低的缺點(diǎn)。楊海霞等[16]采用分光光度法測(cè)定1-DNJ含量，在線性范圍內(nèi)先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性方程，獲得較為精確的定量結(jié)果。龍玲等[17]利用銅離子作為掩蔽劑，1-DNJ與二硫化碳反應(yīng)，有機(jī)溶劑萃取反應(yīng)產(chǎn)物，440nm下測(cè)量產(chǎn)物吸光度，檢測(cè)枯草芽孢桿菌變異菌株中1-DNJ 含量，探討了這一方法的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度以及產(chǎn)物的穩(wěn)定性，找到了一種快速檢測(cè)細(xì)菌發(fā)酵液中1-DNJ含量的方法。

色譜方法可以分離各種生物堿及其他有機(jī)物成分，根據(jù)衍生物化學(xué)特性配以不同的檢測(cè)器對(duì)1-DNJ 進(jìn)行檢測(cè)，如，液相色譜法、離子色譜法和氣相色譜法等。液相色譜一般用到柱前衍生的方法，衍生物與1-DNJ結(jié)合，形成發(fā)色團(tuán)，熒光物質(zhì)比紫外檢測(cè)物質(zhì)檢測(cè)限更低。液相色譜還可以串聯(lián)質(zhì)譜，所測(cè)結(jié)果精確度更高[18]。氣相色譜法具有分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，將1-DNJ衍生化成較低沸點(diǎn)的酯，穩(wěn)定性得到提高，適用于大批量樣品的定量分析[19]。高林森等[20]通過(guò)高效液相色譜——二極管陣列檢測(cè)器法檢測(cè)桑葉中的1-DNJ，在pH8.5 的硼酸鹽緩沖液中用芴甲氧羰酰氯為衍生劑，采用酸提取方法，衍生物在紫外區(qū)有吸收峰，265nm有最大吸收波長(zhǎng)，流動(dòng)相為乙腈和水，C18色譜柱進(jìn)行分離。試驗(yàn)結(jié)果證明，1-DNJ 得到分離，檢出限、線性相關(guān)系數(shù)、樣品加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等結(jié)果非常理想。李名潔等[21]通過(guò)固相萃取——高效液相色譜法測(cè)定不同地域及季節(jié)桑葉中1-DNJ含量，檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，流動(dòng)相為乙腈和醋酸銨水溶液，采用等度洗脫，試驗(yàn)結(jié)果證明：線性關(guān)系、平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等結(jié)果好，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

噴霧質(zhì)譜法可以快速、直接對(duì)樣品中成分進(jìn)行半定量分析，具有簡(jiǎn)單、高效的優(yōu)點(diǎn)，在快速篩選中具有良好的應(yīng)用前景。Ning Zhang等[22]采用葉面噴霧質(zhì)譜法確定了桑樹不同部位1-DNJ的相對(duì)含量，探討了1-DNJ在桑樹中的分布規(guī)律，該方法對(duì)利用桑樹生產(chǎn)功能性或藥用食品和藥物開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

研究展望

桑樹是1-DNJ含量相對(duì)較高的物種之一，但對(duì)桑樹中1-DNJ的開發(fā)研究才剛起步，在提取、純化生產(chǎn)工藝研究等方面還需要深入進(jìn)行。近年來(lái)，超臨界流體萃取技術(shù)和離子液體純化技術(shù)在其他藥用植物方面應(yīng)用頗為廣泛，采用這些新技術(shù)提取和純化桑葉生物堿值得研究。1-DNJ在降血糖、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等方面具有很高的藥用價(jià)值，更多的學(xué)者開始關(guān)注桑樹的開發(fā)利用。充分發(fā)揮桑樹的藥用價(jià)值，對(duì)桑樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展和人類健康具有十分重要的意義。